条斑紫菜丝状体对重金属胁迫的响应及抗性基因gst的克隆与表达-吕娓娓.docx
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1、辽宁师范大学 硕士学位论文 条斑紫菜丝状体对重金属胁迫的响应及抗性基因 GST 的克隆与表 达 姓名:吕娓娓 申请学位级别:硕士 专业:海洋生物学 指导教师:侯和胜 20090501 摘要 条斑紫菜是最具经济价值的栽培海藻之一,也是潮间带藻类的代表性模式物种,具 有很强的抗逆能力,是研究藻类抗逆分子机理的理想材料。 重金属污染会对藻类造成危害,在重金属胁迫下,藻体会通过多种生化途径来体现 自身对重金属的耐受能力。本研究以条斑紫菜丝状体为材料,分析了重金属离子 ( Cu2+ 和 Cd2+)胁迫对其叶绿素 a 含量、过氧化物酶 ( POD)活性以及可溶性蛋白含量的影响。 结果表明,条斑紫菜对 Cd
2、2+具有较高的耐受性。随着 Cu2+和 Cd2+浓度的增加,除了 Cu2+0. lmg/ L 浓度组外,其它各浓度组对条斑紫菜丝状体叶绿素 a 含量、 POD 活性和可 溶性蛋白含量的影响基本上表现为先上升后下降的时间效应关系,且同一重金属离子浓 度越大越早出现下降。 为探索条斑紫菜重金属抗性的分子机制,本实验进一步研究了抗性相关基因 谷 胱甘肽硫转移酶 ( GST)基因。 GST 是一种多功能解毒酶,能够催化谷 胱甘肽和含亲电 子基团的辅基形成谷胱甘肽衍生物,从而达到解毒的目的。本研究利用 RT-PCR 技术克 隆了条斑紫菜GST 基因, BLAST 结果表明该基因属于微粒体谷胱甘肽硫转移酶
3、 ( mGST) 家族,对其进行序列分析发现,该片段含有一个长度为 417bp 的完整开放阅读框,编码 138 个氨基酸,预测蛋白质分子量为 15. 35kDa,理论等电点为 9. 795。疏水性分析表明, GST 基因氨基酸疏水性很强,有 3 个明显疏水区域。信号肽与跨膜结构预测显示条斑紫 菜 GST 是一个具有信号肽的跨膜蛋白。与其他物种 GST 基因编码的氨基酸序列进行比对 分析显示,氨基酸序列相似性为53.63%,由系统发生进化树分析可知,条斑紫菜 GST 基因与莱茵衣藻 ( ED096603.1)和有毒赤潮藻种 ( ABI14355.1)同源关系较近。 运用基因重组技术,成功构建了条
4、斑紫菜 GST 基因原核表达质粒 PGEX-4T-1/GST, 并将重组质粒转化到在 DH5a 中。选用 Cu2+和 Cd2+两种重金属离子研究了转化菌的 重金属耐受性,通过测定转化菌与对照菌的生长曲线发现,表达条斑紫菜 GST 基因的转 化菌对以上两种重金属的耐受性都高于对照菌;而没有重金属 离子存在时,转化菌与对 照菌生长情况基本一致,说明条斑紫菜 GST 基因可能在重金属脱毒中发挥作用。 本研究结果为分析重金属对藻类的影响提供了参考,为更好地理解藻类 GST 及深入 研究其功能奠定了基础,对探索 GST 基因在藻类重金属抗性中的作用具有一定的意义。 关键词:条斑紫菜;重金属;谷胱甘肽硫转
5、移酶;表达分析 Abstract Porphyra yezoensis is one of the most economically important marine crops and is also considered as the representative model algae of the intertidal seaweeds. P. yezoensis has a strong capacity of stress resistance, which makes it an ideal species for the molecular mechanism researc
6、h of alage stress resistance. Heavy metal pollutants are harmful to marine crops. The ability of algae to tolerate heavy metal is determined by multiple biochemical pathways. In this study, the conchocelis of P. yezoensis is taken as experiment material to investigate the effects of heavy metal (Cu2
7、+ and Cd2+) on the contents of chlorophyll a, peroxidase (POD) activity and the soluble protein contents. The results showed that, P. yezoensis has a higher tolerance to Cd2+. With the increase of Cu2+and Cd2+ concentration, the content of chlorophyll a, POD activity and the soluble protein content
8、of the conchocelis appeared a tendency to increased first and then decreased except the groups exposed to lmg/L Cu2+, and the higher the concentrations of the same heavy metal, the earlier the decrease occured. A resistant gene - glutathione S-transferases (GST) gene was studied further to search th
9、e molecular mechanism of the P. yezoensis stress resistance. GSTs is a kind of multifunctional detoxification enzyme which catalyses the conjugation of GSH to a range of electrophilic substrates. The GST gene of P. yezoensis was cloned by RT-PCR technique, the results of BLAST suggested that: this g
10、ene belongs to the gene family of microsomal glutathione S-transferase III and multiple alignment indicated that the deduced amino acid sequence had 53. 63% identity with those of the other species. The cloned cDNA contains an 417bp open reading frame, which encodes for a polypeptide of 138 amino ac
11、id residues with a molecular mass of 15. 35kDa and a pi of 9. 795. The predictions of signal peptide sequence and transmembrane helices in proteins indicated that the GST of P. yezoensis is a transmembrane protein with a signal peptide. The phylogenetic tree showed that it is homology with the Chlam
12、ydomonas reinhardtii (ED096603.1) and Pfiesteria piscicida (ABI14355.1). Using gene recombination technology, the prokaryotic expression vector pGEX-4T-l/GST was successfully constructed and was transformed into E. coli DH5a. The differences between growth curves of the E. coli expressing GST and th
13、e control showed that the coli expressing GST protein had a higher heavy metal-ion (Cu2+and Cd2+) tolerance. However, the growth of E. coli expressing GST was in accord with that of the control group basically when the heavy metal-ion is absent. These results indicate that GST may be involved in hea
14、vy metal detoxification. The results provide some references for researching the effects of heavy metal to alage. The work will contribute to a better understanding of alage GST and help to further analyze the functions of the gene and will make a different for studying resistant mechanism of GST ge
15、ne in alage. Key words: Porphyra yezoensis Heavy metal; Glutathione S-transferases; Analysis of Gene Expression HI 学位论文独创性声明 本人承诺:所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特 别加以标注和致谢的地方外,不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果,其 他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助,均已在论文中做了明确的声明并表示 谢意。 学位论文作者签名 : 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定,
16、及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘,允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学,可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索,可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文,并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名 : 指导教师签名 : 伟说 签名円期 : 年 t 月 W 曰 引言 条 斑 紫 菜 ( / ezoemis) 属 于 红 藻 门 ( Rhodophyta ) 、原红藻纲 (Protoflorideophyceae)、红毛菜目 ( Bangiales)、红毛菜科 ( Bangia
17、ceae)、紫 菜属( Porphyra),为北太平洋西部特有种类,主要分布于我国黄渤海沿岸,以及曰本 列岛和朝鲜半岛沿岸,也是日本和韩国的主要栽培种类 1,由于其富含人体必需的多种 氨基酸、不饱和脂肪酸、多种维生素、胡萝卜素以及无机盐等,营养丰富,口味鲜美, 产品价值高,目前已成为最具经济价值的栽培海藻之一。条斑紫菜的生活史包括叶状配 子体和丝状孢子体两个异型世代 2。由于条斑紫菜具有易于培养,世代周期短等特点, 又是潮间带藻类的代表性模式物种,因此被认为是进行海洋植物特别是多细胞大型藻类 的遗传学、分子生物学及基因组学研究的理想模式生物 3。 重金属污染对条斑紫菜的影响已引起人们广泛关注,
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