第十七章基因重组与基因工程(geneticrecombinationand.ppt
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1、第十七章 基因重组与基因工程 (genetic recombination and genetic engineering),基因重组 是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接,组成一个新的DNA分子的过程,又称DNA重组。基因克隆 将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中,使其扩增和繁殖,以获得大量的同一DNA分子,称此为基因克隆、DNA克隆或分子克隆。基因工程 实现基因克隆所采用的方法和相关工作,统称为重组DNA技术或基因工程。,本章主要内容 重要的工具酶 基因克隆常用的载体 重组DNA基本原理 重组技术在医学和制药 工业中的应用,第一节 重要的工具酶,工具酶 基因工程中的工具酶
2、主要是指用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、修饰、反转录等有关的各种酶系统。,一、限制性核酸内切酶(RE) 是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键 的核酸内切酶,简称限制酶或切割酶。 根据限制酶的作用特性,一般分为三类: 、和型, 其中常用的是型限制酶。,限制酶(型)识别及切割位点 特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断,主要产生3种缺口: 5粘性末端 3粘性末端 平端或钝端 回文序列 是指该部位的核苷酸序列呈180O旋转对称; 粘性末端 是指经内切酶特异切割后产生的5末端突出或3末端突出的碱基序列相互具有互补性。, 产生5-粘性末端
3、, 产生3-粘性末端, 产生平(头末)端/钝端,其它特殊性质的型限制酶,同裂酶(异源同工酶)同尾酶可变酶,同裂酶,又称异源同工酶。指来源不同,但具有相同的识别序列。 在切割DNA时,其切割点可以是相同的,产生平头末端,称为同识同切; 切割点也可以是不同的,产生3或5粘性末端,称为同识异切。,同裂酶同识同切,同裂酶同识异切,同 尾 酶,同尾酶 指来源不同,但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。,可变酶,可变酶 识别顺序中的一个或几个碱基是可变的,并且识别顺序往往超过6个碱基对。 如, Bstp,其识别顺序为GGTNACC。,常用限制性核酸内切酶的特性,二、DNA聚
4、合酶,(最常用的DNA聚合酶有以下4种) DNA聚合酶 DNA聚合酶大片段Klenow片段 Taq DNA聚合酶 T4 噬菌体DNA聚合酶, DNA聚合酶,E.Coli DNA聚合酶(DNA pol ) 是一个具有3 种酶活性的多功能性酶。包括: 53DNA 聚合酶活性 53核酸外切酶活性 35核酸外切酶活性,DNA pol 应用, 催化DNA缺口平移反应,制备高比活性DNA 探针; 第二条cDNA链的合成; 对DNA3突出末端进行标记; DNA序列分析。,E. coli DNA pol. 催化切口平移, Klenow片段(DNA pol.大片断),Klenow片段用途, 补齐双链DNA的 3
5、末端; 用标记碱基补 齐3末端 ;, 在cDNA克隆中, 用于第二股链 的合成; DNA序列分析。, Taq DNA pol(耐热DNA聚合酶),作用特点1) Taq DNA pol催化DNA合成的最适温度范围 70 75,2) 95以上高温,半小时不失活, 3) 最适合用于聚合酶链反应(PCR)。,三、逆转录酶,特点 逆转录酶是一个多功能性酶,至少具有以下3种酶活性: 以单链RNA 为模板, 催化合成cDNA单链 具有RNase H 活性,能水解RNA:DNA杂交链中的 RNA 以DNA为模板,催化合成cDNA双链。,逆转录酶的应用: 将mRNA逆转录成cDNA,构建cDNA文库; 补平和标
6、记5-末端突出的DNA片段; 代替Klenow酶用于DNA序列分析; 制备杂交探针等。,四、DNA连接酶(DNA ligase),DNA连接酶可以 催化带有粘性末端或平头末端的双链DNA中一条链的3OH与另一条链的5PO3H2形成磷酸二酯键而相连,从而构成一条完整的DNA长链。 DNA连接酶的用途(1) 两个双链DNA片段连接起来5- ACG AATTCGT-3 T4DNA连接酶 5-ACGAATTCGT-33- TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5(2) 修补带有缺口的双链DNA分子,五、碱性磷酸酶,碱性磷酸酶(BAP) 能够催化水解去除DNA或RNA5-端的磷酸基团。用
7、途 制备载体时,用碱性磷酸酶处理去除载体分子 5端磷酸基后,可防止载体自身环化连接,提高重组效率。 用32P标记5-端前,去除5-P,再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5-端进行标记。,六、末端 (脱氧核苷酸)转移酶(TdT),作用 将标记或未标记的dNTP加到DNA的3OH末端;也可催化载体分子或待克隆的DNA片断上加上互补的同聚尾,便于进一步连接。应用 探针标记,P32-.dGTP,G32G32G32G32,G32G32G32G32, 在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾,以便于进行连接,重要的工具酶,第二节 基因克隆常用的载体,载体(vector) 是将外源DNA(目的DNA)片断引入宿主细
8、胞的运载工具,其化学本质为DNA 。,本节主要内容 载体必须具备的基本条件 载体的种类 常用的载体,一、载体必须具备的基本条件, 有自身的复制子,能独立复制 具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点) 具有遗传表型或筛选标记 有足够的容量以容纳外源DNA片段。 表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动 子、前导序列、增强子等调控元件。 载体DNA中均有一段非必需区,将外源基因插入 该非必需区,而载体本身不受影响。,二、载体的种类*,(一) 克隆载体 用来克隆和扩增DNA片段的载体,具有3点共性: 能够在受体细胞复制; 带有药物抗性基因,便于筛选; 可导入受体细胞。(二)表达载体 除具有克隆载体所具
9、有的性质外,还带有表达构件转录和翻译所必须的DNA顺序。,三、常用的载体,(一) 质粒 (plasmid):,是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分子。 作为克隆载体的质粒应具备以下特点: 1. 分子量相对较小,能稳定存在于细菌体内, 有较高的拷贝数 2. 具有1个以上的遗传标志,便于筛选 3. 具有多克隆位点,总而言之,质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的“松弛型”质粒,且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。广泛应用的质粒: pBR32质粒、pUC系列等,pBR322质粒, 4363 bp 含一个复制点含一个抗氨卞青霉素标 记(ampR) 一个抗四环素标记 (tetR)
10、ampR和tetR基因内各有一些限制酶的酶切位点,供外源基因插入 当外原基因插入抗药基因位点时,AmpRAmp敏感(AmpS )、TetRTet敏感(TetS).,pUC系列质粒,由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体;(1) 2674bp;(2) 有ampr和与M13噬菌体 相同的多克隆位点(MCS)(3)有一个来自大肠杆菌的LacZ操纵子的DNA片断, 编码半乳糖苷酶,(二)噬菌体,组成特点: 双链线状DNA分子, 全长50kb, 含65个基因, 在其分子两端各含有12个碱基的互补单链,是天然的粘性末端,被称为COS位点。,噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长 溶菌性生长(
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