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1、书书书第卷第期年月西安交通大学学报(医学版)犑狅狌狉狀犪犾狅犳犡犻犪狀犑犻犪狅狋狅狀犵犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔(犕犲犱犻犮犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊)犞狅犾犖狅犖狅狏:;:技术方法脂质体及电穿孔法对大鼠雪旺细胞转染效率的比较与分析菅辉玲,黄瑾,程江,高蕊,(石河子大学医学院生物化学教研室,新疆石河子;华中科技大学同济医学院,湖北武汉;石河子大学第一附属医院检验科,新疆石河子)摘要:目的对比脂质体与电穿孔法及不同载体对大鼠雪旺细胞的转染效率,为进一步研究神经胶质细胞奠定实验基础。方法以大鼠雪旺细胞为研究对象,采用脂质体法和电穿孔法分别转染绿色荧光蛋白()载体和羧基荧光素()标记的,比较和分析两者的转染效率
2、。结果脂质体转染法成功转染质粒大鼠雪旺细胞的效率为(),转染的效率为();采用电穿孔法转染质粒的效率高达(),而该法转染的效率则非常低。结论大鼠雪旺细胞的转染效率可能与转染方式、被转染物的大小和形式有关。关键词:大鼠雪旺细胞;电穿孔法;脂质体转染法中图分类号: 文献标志码: 文章编号:()犇犗犐:犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀犪狀犱犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋狉犪狀狊犳犲犮狋犻狅狀犲犳犳犻犮犻犲狀犮狔狅犳狉犪狋犛犮犺狑犪狀狀犮犲犾犾狊犫狔犾犻狆狅犳犲犮狋犻狅狀犪狀犱犲犾犲犮狋狉狅狆狅狉犪狋犻狅狀,(,;,;,)犃犅犛犜犚犃犆犜: 犜狅犮狅犿狆犪狉犲狋犺犲狋狉犪狀狊犳犲犮狋犻狅狀犲犳犳犻犮犻犲狀犮狔犫犲狋狑犲犲
3、狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋狋狉犪狀狊犳犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱狊犪狀犱犱犻犳犳犲狉犲狀狋狏犲犮狋狅狉狊犻狀狉犪狋犛犮犺狑犪狀狀犮犲犾犾狊狊狅犪狊狋狅狆狉狅狏犻犱犲犲狓狆犲狉犻犿犲狀狋犪犾犫犪狊犻狊犳狅狉犳狌狉狋犺犲狉狊狋狌犱狔狅犳犵犾犻犪犾犮犲犾犾狊 犌犉犘狆犾犪狊犿犻犱犪狀犱犉犃犕犾犪犫犲犾犲犱犿犻犚犖犃犿犻犿犻犮狊狑犲狉犲狋狉犪狀狊犳犲犮狋犲犱犻狀狋狅狉犪狋犛犮犺狑犪狀狀犮犲犾犾狊犫狔狌狊犻狀犵犾犻狆狅犳犲犮狋犻狅狀犪狀犱犲犾犲犮狋狉狅狆狅狉犪狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱狊,狉犲狊狆犲犮狋犻狏犲犾狔犃狀犱狋犺犲狋狉犪狀狊犳犲犮狋犻狅狀犲犳犳犻犮犻犲狀犮狔狅犳狋犺犲狋狑狅犿犲狋犺狅犱狊狑犪狊犮狅犿狆犪狉犲
4、犱 犜犺犲犲犳犳犻犮犻犲狀犮狔狅犳犌犉犘狏犲犮狋狅狉犪狀犱犿犻犚犖犃犿犻狀犿犻犮狊狋狉犪狀狊犳犲犮狋犲犱犫狔犾犻狆狅犳犲犮狋犻狅狀狑犪狊()犪狀犱(),狉犲狊狆犲犮狋犻狏犲犾狔犆狅犿狆犪狉犲犱狑犻狋犺犾犻狆狅犳犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱,狋犺犲犲犳犳犻犮犻犲狀犮狔狅犳犌犉犘狏犲犮狋狅狉狋狉犪狀狊犳犲犮狋犲犱犫狔犲犾犲犮狋狉狅狆狅狉犪狋犻狅狀狑犪狊狌狆狋狅(),狑犺犻犾犲狋犺犲犲犳犳犻犮犻犲狀犮狔狅犳犿犻犚犖犃犿犻狀犿犻犮狊狑犪狊狉犪狋犺犲狉犾狅狑 犜犺犲犲犳犳犻犮犻犲狀犮狔狅犳狉犪狋犛犮犺狑犪狀狀犮犲犾犾狊狋狉犪狀狊犳犲犮狋犻狅狀犻狊狆狉狅犫犪犫犾狔犪狊狊狅犮犻犪狋犲犱狑犻狋犺狋狉犪狀狊犳犲犮狋
5、犻狅狀犿犲狋犺狅犱犪狊狑犲犾犾犪狊狋犺犲狊犻狕犲犪狀犱犳狅狉犿狅犳狋犺犲狋狉犪狀狊犳犲犮狋犲犱犮狅犿狆犾犲狓犲狊犓犈犢犠犗犚犇犛:狉犪狋犛犮犺狑犪狀狀犮犲犾犾;犲犾犲犮狋狉狅狆狅狉犪狋犻狅狀;犾犻狆狅犳犲犮狋犻狅狀收稿日期: 修回日期:基金项目:国家自然科学基金资助项目();石河子大学“”青年骨干教师资助计划项目()()()通讯作者:高蕊,讲师:作者简介:菅辉玲(),女(汉族),硕士研究生研究方向:临床分子生物学:网络出版时间: 网络出版地址:细胞转染方法主要包括病毒和非病毒载体法。病毒载体法由于安全性、免疫排斥等问题而未能广泛应用;非病毒载体法主要有脂质体和电穿孔法。脂质体是由脂质双分子层组
6、成的囊状载体,可以包裹外源基因后与细胞膜融合内吞,从而导入外源基因,现最常用的是阳离子脂质体;电穿期菅辉玲,黄瑾,程江,等脂质体及电穿孔法对大鼠雪旺细胞转染效率的比较与分析:;:孔法则是通过高强度电脉冲引发细胞膜结构的一过性改变,致暂时可逆性膜渗透性增加,膜上出现亲水性孔道,促进非渗透性外源性大分子物质如基因、药物等进入细胞内的技术。随着基因转染技术的快速发展,转染方法、转染的载体形式及标记日益增多。转染方法及载体的选择尤为重要。雪旺氏细胞是一种周围神经特有的胶质细胞。于年首次发现,并随后证实其在周围神经的发生、发育、形态、功能维持等方面起重要作用。研究表明,雪旺细胞可以分泌多种神经营养因子和
7、神经生长因子,促进轴突再生。现有关雪旺细胞的研究主要集中在脊髓损伤、周围神经损伤和中枢神经系统脱髓鞘性疾病等的功能恢复方面。雪旺细胞已经作为理想的工具细胞被广泛应用于研究神经的损伤、修复、再生以及各种神经系统疾病的发生发展与治疗过程中。但其面临的一大难题是转染率较低,已经成为制约着雪旺细胞相关的分子生物学研究的瓶颈。公司开发出的电转仪和配套电转液是目前报道最为高效的转染细胞工具,目前鲜见该仪器用于质粒和小分子转染大鼠雪旺细胞的文献报道。基于此,本实验以大鼠雪旺细胞()为研究对象,利用脂质体和电穿孔法两种转染方法,比较标记绿色荧光蛋白()的大片段载体和标记羧基荧光素()的小片段的转染效率,为深入
8、研究神经胶质细胞提供基础数据。 材料与方法 实验材料大鼠雪旺细胞()购自上海中科院细胞研究所。电转仪及电转液均购自公司;质粒(公司)由皮文辉博士(新疆农垦科学院)惠赠;羧基荧光素()标记的由上海吉玛公司合成;购自公司;高糖培养基及胎牛血清()均购自公司;青霉素和链霉素购自华北制药厂。 方法 大鼠雪旺细胞()的培养大鼠雪旺细胞()是一种贴壁培养细胞,所用培养液成分为高糖(含胎牛血清,青霉素和链霉素),在细胞培养瓶中培养,每日换液,传代次。 脂质体转染法转染时取传代次的细胞(对数生长期),以接种至孔板,每孔设两个复孔。完全培养基(含胎牛血清,青霉素和链霉素的高糖)培养,细胞长满左右,准备转染。将质
9、粒及用相应脂质体转染(详细步骤参见产品说明书),后荧光显微镜下计算转染效率。 电穿孔转染法传代次的细胞长满时可用于转染,冲洗遍,胰酶消化,完全培养基终止消化。收集细胞悬液后离心,弃上清,无血清培养基悬浮细胞后计数。以每孔分配至管,每孔设两个复孔,离心,弃上清,加入电转液悬浮细胞并分别加入质粒或(详细步骤见),移入电穿孔杯,调节电转仪选择转染默认程序进行电击,室温静置后加培养基移至孔板培养。后在荧光显微镜下计算转染效率。 转染效率的测定用洗涤贴壁细胞遍后置显微镜下观察,由于与均为绿色荧光,显微参数为激发波长,发射波长。以倍的视野为标准,两人同时独立估计相同视野下绿色荧光细胞数,每孔共计个高倍镜视
10、野。该孔转染效率()绿色荧光细胞数总细胞数,取个视野平均值,每组孔均值为转染效率最终结果。 统计学方法采用软件处理数据。所有数据以珔狓狊表示,两组间比较采用独立样本狋检验,以犘为差异有统计学意义。 结果 不同转染方式对转染效率的影响 脂质体转染法和电穿孔法介导质粒转染效率的比较如图所示,利用脂质体转染质粒至大鼠雪旺细胞所获得的阳性转染率约为(),而电穿孔法转染效率显著增高至()。说明针对这类较难转染的神经胶质细胞,电穿孔法转染质粒的转染效率要较脂质体法优良(犘)。 脂质体和电穿孔转染法介导转染效率的比较羧基荧光素()标记的片段较小,脂质体转染大鼠雪旺细胞的效率为(),而利用电穿孔法几乎看不到绿
11、色标记细胞。可能是由于电穿孔法对羧基荧光素西安交通大学学报(医学版)第卷:;:()标记的影响很大,瞬时的高压电脉冲影响到羧基荧光素的活性,所以对于小片段基因的导入,脂质体转染法优势更明显(犘,图)。图 脂质体转染法与电穿孔法转染狆犿犪狓犌犉犘质粒对比图:脂质体法转染();:电穿孔法转染()。图 脂质体转染法与电穿孔法转染犿犻犚犖犃犿犻犿犻犮狊的对比图:脂质体法转染();:电穿孔法转染()。 不同载体形式对转染效率的影响比较的脂质体转染载体及效率后发现,与转染大片段质粒的效率相比,脂质体对小分子的的转染效率较高(犘)。相反,电穿孔法可使得较大的质粒转染效率明显高于小片段(犘,表)。 讨论大鼠雪旺
12、细胞是一种在神经修复过程中起重要作用的神经胶质细胞。研究表明,该类细胞转染效率较低。为了更好地研究其生理功能及调控机制,表 脂质体法和电穿孔法转染狆犿犪狓犌犉犘质粒与犿犻犚犖犃犿犻犿犻犮狊效率的比较 (珔狓狊,狀)转染物脂质体组电穿孔组质粒与脂质体组比较,犘;与质粒比较,犘。需提高其转染效率。本实验就不同转染方法和转染物大小与形式进行转染效率的对比实验。选取较大分子带绿色荧光蛋白的质粒和小分子带羧基荧光素()的为转染物,以新型常用的阳离子脂质体和两种方法分别转染。利用脂质体法转染质粒的转染效率约为(),这与王旭凯等的实验结果相符合。而转染的转染效率较高为(),表明对于这类神经胶质细胞,脂质体更
13、容易包裹吞入片段较小的转染物。而使用电穿孔法明显改善大片段载体低转染效率的情况,使其提高至()。在高压电脉冲过程中可能会使小片段转染物或受到不可逆转的损伤,使其荧光淬灭进而被漂洗掉,因此难以观察到荧光信号。说明电穿孔法更适合用于常规的环状质粒转染构建工程细胞;而对于小片段线性的转染物,脂质体的转染方法优势更明显。提示细胞转染过程中,转染载体和转染物的大小和形式均有重要作用。本研究的结果为更好地研究神经胶质细胞的生理变化和作用机制积累了基础数据。参考文献:周雪雁,关伟军,马月辉,等脂质体介导转染法原理及其研究进展犑上海畜牧兽医通讯,():杨孝军,李均电穿孔技术的研究及应用进展犑中国康复医学杂志,
14、():顾立强,秦煜,叶震海雪旺细胞与周围神经组织工程犑现代康复,():犖犌犅犓,犆犎犈犖犔,犕犃犖犇犈犕犃犓犈犚犛犠,犲狋犪犾犃狀狋犲狉狅犵狉犪犱犲狋狉犪狀狊狆狅狉狋犪狀犱狊犲犮狉犲狋犻狅狀狅犳犫狉犪犻狀犱犲狉犻狏犲犱狀犲狌狉狅狋狉狅狆犺犻犮犳犪犮狋狅狉犪犾狅狀犵狊犲狀狊狅狉狔犪狓狅狀狊狆狉狅犿狅狋犲犛犮犺狑犪狀狀犮犲犾犾犿狔犲犾犻狀犪狋犻狅狀犑犑犖犲狌狉狅狊犻犮,():犖犈犠犅犈犚犖犑,犅犐犚犆犎犕犈犐犈犚犆犖狉犵犠狉犫犅狊犻犵狀犪犾犻狀犵狀犲狋狑狅狉犽狊犻狀犛犮犺狑犪狀狀犮犲犾犾犱犲狏犲犾狅狆犿犲狀狋犪狀犱犿狔犲犾犻狀犪狋犻狅狀犑犛犲犿犻狀犆犲犾犾犇犲狏犫犻狅犾,():(下转第页)期邓景元
15、,吴琼,彭宇,等综合疗法治疗脑卒中后吞咽障碍的临床研究:;:贾晓玲,李霞高压氧并针刺治疗脑卒中后吞咽障碍犑中国康复,():张晓霞,孔立中西医结合治疗卒中后吞咽障碍的疗效观察犑中国实用医药,():犕犃犖犖犌,犎犃犖犓犈犢犌犑,犆犃犕犈犚犗犖犇犛狑犪犾犾狅狑犻狀犵犱犻狊狅狉犱犲狉狊犳狅犾犾狅狑犻狀犵犪犮狌狋犲狊狋狉狅犽犲:狆狉犲狏犪犾犲狀犮犲犪狀犱犱犻犪犵狀狅狊狋犻犮犪犮犮狌狉犪犮狔犑犆犲狉犲犫狉狅狏犪狊犮犇犻狊,():张婧,周筠,徐晓彤,等脑卒中后吞咽障碍的异常模式犑中国康复医学杂志,():于大川,陈曦,朱东强中风后遗症之吞咽障碍的综合康复治疗犑吉林大学学报:医学版,():马力,艾长山中风后吞咽
16、障碍康复方法的临床研究犑世界中西医结合杂志,():郭淼,张晓霞脑卒中后吞咽障碍研究进展犑中医临床研究,():彭文伟现代感染性疾病与传染病学犕北京:科学出版社,王海侨,黄涛,谭峰,等电针配合吞咽障碍治疗仪治疗急性脑卒中吞咽障碍的疗效观察犑中国现代药物应用,():吴永刚,刘远声,罗文舒,等调任通督针法治疗假性球麻痹吞咽障碍临床研究犑中国中医急症,():,武平,梁繁荣,李瑛,等针刺联合康复训练治疗脑卒中后吞咽障碍多中心随机对照临床观察犑中医杂志,():张星德,姚红学针刺与吞咽训练治疗脑卒中后吞咽障碍的研究犑中国康复医学杂志,():孔岳南,孙杨电刺激疗法治疗脑卒中后吞咽障碍的疗效研究犑神经疾病与精神卫
17、生,():董继革,孙丽,李广庆综合疗法对卒中后吞咽障碍的疗效观察犑中西医结合心脑血管病杂志,():方丽波,王拥军脑卒中后吞咽困难的康复及治疗犑中国康复理论与实践,():王瑞华神经性吞咽障碍的评定与治疗犑中国康复理论与实践,():林彩洪,莫维一早期康复护理对脑卒中患者生活质量的影响犑现代护理,():(编辑国荣櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵)(上接第页)犕犗犗犚犈犆犛,犃犅犇犝犔犔犃犎犛犔,犅犚犗犠犖犃,犲狋犪犾犎狅狑犳犪犮狋狅狉狊狊犲犮狉犲狋犲犱犳狉狅犿犪狊狋狉狅犮狔狋犲狊犻犿狆犪犮狋犿狔犲犾犻狀狉犲狆犪犻狉犑犑犖犲狌狉狅狊犮
18、犻犚犲狊,():犛犜犈犈犇犕犅,犕犝犓犎犃犜犢犃犚犞,犞犃犔犕犐犓犐犖犃犜犎犃犖犆,犲狋犪犾犃犱狏犪狀犮犲狊犻狀犫犻狅犲狀犵犻狀犲犲狉犲犱犮狅狀犱狌犻狋狊犳狅狉狆犲狉犻狆犺犲狉犪犾狀犲狉狏犲狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀犑犃狋犾犪狊犗狉犪犾犕犪狓犻犾犾狅犳犪犮犛狌狉犵犆犾犻狀犖狅狉狋犺犃犿,():犘犃犘犃犛犜犈犉犃犖犃犓犐犉,犆犎犈犖犑,犔犃犞犃犇犃犛犃犃,犲狋犪犾犌狉犪犳狋狊狅犳犛犮犺狑犪狀狀犮犲犾犾狊犲狀犵犻狀犲犲狉犲犱狋狅犲狓狆狉犲狊狊犘犛犃犖犆犃犕狆狉狅犿狅狋犲犳狌狀犮狋犻狅狀犪犾狉犲犮狅狏犲狉狔犪犳狋犲狉狊狆犻狀犪犾犮狅狉犱犻狀犼狌狉狔犑犅狉犪犻狀,():犘犈犃犚犛犈犇犇,犛犃犖犡犎犈犣犃
19、犚,犘犈犚犈犐犚犃犉犆,犲狋犪犾犜狉犪狀狊狆犾犪狀狋犪狋犻狅狀狅犳犛犮犺狑犪狀狀犮犲犾犾狊犪狀犱狅狉狅犾犳犪犮狋狅狉狔犲狀狊犺犲犪狋犺犻狀犵犵犾犻犪犻狀狋狅狋犺犲犮狅狀狋狌狊犲犱狊狆犻狀犪犾犮狅狉犱:犛狌狉狏犻狏犪犾,犿犻犵狉犪狋犻狅狀,犪狓狅狀犪狊狊狅犮犻犪狋犻狅狀,犪狀犱犳狌狀犮狋犻狅狀狉犲犮狅狏犲狉狔犑犌犾犻犪,():犉犃犖犛犃犎,犓犈犐犔犎犗犉犉犌,犉犗犚犛犜犈犚犌,犲狋犪犾犃犮犲犾犾狌犾犪狉犿狌狊犮犾犲狑犻狋犺犛犮犺狑犪狀狀犮犲犾犾犻犿狆犾犪狀狋犪狋犻狅狀:犪狀犪犾狋犲狉狀犪狋犻狏犲犫犻狅犾狅犵犻犮狀犲狉狏犲犮狅狀犱狌犻狋犑犑犚犲犮狅狀狊狋狉犕犻犮狉狅狊狌狉犵,():犓犗犆犛犐犛犑犇
20、,犠犃犡犕犃犖犛犌犛犮犺狑犪狀狀犮犲犾犾狊犪狀犱狋犺犲犻狉狆狉犲犮狌狉狊狅狉狊犳狅狉狉犲狆犪犻狉狅犳犮犲狀狋狉犪犾狀犲狉狏狅狌狊狊狔狊狋犲犿犿狔犲犾犻狀犑犅狉犪犻狀,():许期年,王秀云,左剑玲,等种脂质体介导法转染大鼠小胶质细胞的比较研究犑山东医药,():王旭凯犌犇犖犉基因修饰的雪旺细胞对大鼠脊髓损伤保护作用的实验研究犇吉林:吉林大学外科学专业,(编辑卓选鹏櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵)(上接第页)犓犈犈犉犉犈犈犅,犇犐犈犜犈犚犐犆犎犇犜,犎犃犖犛犎犅,犲狋犪犾犜狉犲犪狋犿犲狀狋犪犾犵狅狉犻狋犺犿犳狅狉狋犺犲犿犪狀犪犵犲
21、犿犲狀狋狅犳犮犺狉狅狀犻犮犺犲狆犪狋犻狋犻狊犅狏犻狉狌狊犻狀犳犲犮狋犻狅狀犻狀狋犺犲犝狀犻狋犲犱犛狋犪狋犲狊:犪狀狌狆犱犪狋犲犑犆犾犻狀犌犪狊狋狉狅犲狀狋犲狉狅犾犎犲狆犪狋狅犾,():黄俊华犃犔犜正常的犎犅犞慢性携带者肝组织病例结果分析犑临床肝胆病杂志,():彭文伟现代感染性疾病与传染病学犕北京:科学出版社,:犢犃犖犌犎犐,犔犝犛犖,犔犐犃犠犢犉,犲狋犪犾犎犲狆犪狋犻狋犻狊犅犲犪狀狋犻犵犲狀犪狀犱狋犺犲狉犻狊犽狅犳犺犲狆犪狋狅犮犲犾犾狌犾犪狉犮犪狉犮犻狀狅犿犪犑犖犈狀犵犾犑犕犲犱,():犆犎犗犖犆犢,犎犃犖犓犎,犔犈犈犓犛,犲狋犪犾犘犲狉犻狋狅狀犲狅狊犮狅狆犻犮犾犻狏犲狉犫犻狅狆狊狔犳犻狀犱犻狀犵狊犻狀犪狊狔犿狆狋狅犿犪狋犻犮犮犺狉狅狀犻犮犺犫狊犪犵犮犪狉狉犻犲狉狊狑犻狋犺狀狅狉犿犪犾犾犻狏犲狉犳狌狀犮狋犻狅狀狋犲狊狋狊犪狀犱狀狅犺犲狆犪狋狅犿犲犵犪犾狔犑犢狅狀狊犲犻犕犲犱犑,():陈明胜,孔金峰,甘巧蓉,张元芬肝功能正常的慢性乙肝病毒感染者病理分析犑中西医结合肝病杂志,():王昱肝功能正常与轻度异常的慢性乙肝患者临床病理及免疫指标比较分析犑实用医学杂志,():(编辑卓选鹏)
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