条锈菌诱导下的小麦叶片总RNA提取方法的比较及LD2PCR.PDF
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1、麦 类 作 物 学 报 2007 ,27 (3) :471 - 474Journal of Triticeae Crops条 锈 菌 诱 导 下 的 小 麦 叶 片 总 RNA 提 取方 法 的 比 较 及 LD2PCR扩 增 3余 宇 ,王 晓 杰 ,韩 青 梅 ,康 振 生(西 北 农 林 科 技 大 学 植 物 保 护 学 院 ,陕 西 省 农 业 分 子 生 物 学 重 点 实 验 室 , 陕 西 杨 凌 712100)摘 要 : 为 寻 找 一 种 既 能 提 取 到 高 质 量 高 产 量 小 麦 RNA、 又 能 提 取 到 高 质 量 条 锈 菌 RNA 的 方 法 ,利 用T
2、rizol 法 、 Licl 法 、 SDS 法 和 Bizol 法 分 别 从 条 锈 菌 诱 导 的 小 麦 叶 片 中 提 取 了 总 RNA ,并 对 Trizol 法 和 Bizol 法提 取 的 RNA 进 行 了 长 距 离 PCR(LD2PCR)扩 增 。 结 果 表 明 , Trizol 法 、 Licl 法 、 SDS 法 和 Bizol 法 提 取 的 RNA产 量 ( g/ 100 mg 鲜 重 叶 片 )分 别 为 4. 72、 1. 15、 1. 56、 10. 43 g/ 100 mg , Trizol 法 和 Bizol 法 提 取 的 RNA 产 量明 显 高
3、 于 Licl 法 和 SDS 法 。 Trizol 法 提 取 的 RNA 合 成 的 cDNA 片 段 大 小 主 要 集 中 在 0. 25 2. 0 kb 范 围 内 ,而 Bizol 法 提 取 的 RNA 合 成 的 cDNA 片 段 大 小 主 要 集 中 在 0. 5 5. 0 kb 范 围 内 ,Bizol 法 提 取 的 RNA 反 转 录合 成 的 cDNA 质 量 好 于 Trizol 法 。 Bizol 法 同 样 能 提 取 到 高 质 量 的 条 锈 菌 RNA ,而 且 提 取 RNA 的 成 本 较 低 。综 合 各 种 因 素 ,Bizol 法 是 条 锈
4、菌 诱 导 下 的 小 麦 叶 片 总 RNA 提 取 的 较 理 想 方 法 。关 键 词 : 小 麦 ; 条 锈 菌 ; RNA ; LD2PCR中 图 分 类 号 :S512. 1 ;S332. 2 文 献 标 识 码 : A 文 章 编 号 :100921041 (2007) 0320471204Comparison of Different Protocols of Extracting Total RNA from RustInduced Wheat Leaves and LD2PCR Amplif icationY U Yu , WANG Xiao2jie , HAN Qing2
5、mei , KANG Zhen2sheng( Plant Protection College and Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture , Nort hwestA Yellow Rust ; RNA ; LD2PCR小 麦 条 锈 病 是 由 小 麦 条 锈 菌 ( Pucci ni a st ri2i f ormis f . sp . t ritici. )引 起 的 一 种 世 界 性 小 麦 病害 之 一 。 条 锈 菌 是 一 种 专 性 寄 生 菌 ,没 有 有 性 世代 ,也 不 能 离 体 培
6、 养 1 。 目 前 ,对 它 在 寄 主 中 的 侵3 收 稿 日 期 :2006212229 修 回 日 期 :2007202210基 金 项 目 :教 育 部 长 江 学 者 和 创 新 团 队 发 展 计 划 项 目 ( IR T0558) ;教 育 部 重 大 科 技 培 育 项 目 (20042225) ;国 家 自 然 科 学 基 金 资 助项 目 (30671350) 。作 者 简 介 :余 宇 (1984 - ) ,男 ,在 读 硕 士 ,主 要 从 事 小 麦 2条 锈 菌 互 作 的 分 子 生 物 学 研 究 。通 讯 作 者 :康 振 生 (1957 - ) ,男 ,
7、博 士 生 导 师 ,教 授 ,主 要 从 事 病 原 物 与 寄 主 植 物 互 作 关 系 的 生 物 学 和 分 子 生 物 学 研 究 。染 过 程 、 吸 器 发 育 的 细 胞 学 和 组 织 学 研 究 已 经 取得 了 很 大 进 展 2 5 ,但 其 遗 传 方 面 的 研 究 相 对 比较 滞 后 ,对 于 它 与 寄 主 识 别 的 分 子 机 制 、 病 原 菌 生长 发 育 以 及 其 无 毒 基 因 和 致 病 相 关 基 因 还 不 清楚 。 基 因 组 学 时 代 的 到 来 ,为 研 究 小 麦 2条 锈 菌 互作 提 供 了 一 些 新 的 技 术 手 段
8、。 应 用 功 能 基 因 组 学研 究 方 法 ,如 cDNA 文 库 、 SSH 文 库 、 微 阵 列 、 cD2NA2A FL P 等 技 术 可 筛 选 到 条 锈 菌 侵 染 过 程 中 的致 病 相 关 基 因 及 小 麦 的 抗 病 相 关 基 因 ;应 用 分 子标 记 技 术 可 对 致 病 基 因 和 抗 病 相 关 基 因 进 行 精 确定 位 。 要 开 展 这 些 研 究 ,高 质 量 RNA 的 提 取 是一 个 重 要 前 提 。 目 前 ,提 取 小 麦 总 RNA 的 方 法有 很 多 ,如 异 硫 氰 酸 胍 一 步 法 6 、 苯 酚 法 7 、 Lic
9、l沉 淀 法 8 、 CTAB 法 9 、 SDS 法 8 等 ,但 尚 未 见 一种 既 能 有 效 提 取 到 高 质 量 且 高 产 量 的 小 麦 RNA、又 能 提 取 到 高 质 量 条 锈 菌 RNA 的 方 法 。 特 别 对于 不 易 获 取 的 材 料 或 者 需 要 大 量 RNA 的 实 验(譬 如 分 子 杂 交 ) ,高 质 量 、 高 产 量 RNA 的 提 取 方法 就 显 得 尤 为 重 要 。 本 研 究 以 Txizol 等 4 种 方法 分 别 提 取 条 锈 菌 诱 导 的 小 麦 叶 片 总 RNA ,旨 在筛 选 出 高 质 量 、 高 产 量 R
10、NA 的 提 取 方 法 ,为 小 麦和 锈 菌 之 间 互 作 的 深 入 研 究 创 造 条 件 。1 材 料 与 方 法1. 1 材 料试 验 供 试 小 麦 品 种 为 水 源 11 ,条 锈 菌 选 择 条中 31 号 生 理 小 种 ,二 者 均 由 西 北 农 林 科 技 大 学 植物 免 疫 研 究 室 提 供 。1. 2 方 法1. 2. 1 小 麦 叶 片 及 条 锈 菌 的 采 集 小 麦 品 种 水源 11 生 长 7 d 后 ,用 条 锈 菌 条 中 31 号 小 种 接 种第 一 片 真 叶 ,保 湿 24 h 后 于 温 室 培 养 ,192 h 采 集接 种 叶
11、 片 ,锡 箔 纸 包 好 ,液 氮 迅 速 冷 冻 后 放 于- 80 保 存 备 用 。条 锈 菌 条 中 31 号 生 理 小 种 在 铭 贤 169 小 麦品 种 上 按 照 常 规 方 法 1 繁 殖 ,菌 种 真 空 干 燥 后 置于 - 80 保 存 备 用 。1. 2. 2 小 麦 叶 片 总 RNA 的 提 取 称 取 100 mg鲜 重 小 麦 叶 片 置 于 液 氮 中 ,快 速 研 磨 成 粉 状 ,分 别用 Trizol 法 、 Licl 法 、 SDS 法 和 Bizol 法 提 取 条 锈菌 诱 导 的 小 麦 叶 片 总 RNA (表 1) 。1. 2. 3 R
12、NA 的 纯 化 在 微 量 离 心 管 中 分 别 加 入总 RNA 43. 5 L 、 10 DNase Buffer 5 L 、DNase ( RNase free ,5 U/ L ) 1 L 、 RNase in2hibitor (40 U/ L) 0. 5 L ,37 水 浴 30 min ;加 入450 L 的 DEPC 水 ,加 入 等 体 积 (500 L)苯 酚 氯 仿 异 戊 醇 (25 24 1) ;充 分 混 匀 ,冰 浴 15min ;4 12 000 rp m 离 心 15 min ,取 上 清 转 移 至另 一 离 心 管 。 加 入 等 体 积 (500 L )
13、 氯 仿 ,充 分 混匀 ,冰 浴 15 min ,4 ,12 000 rp m 离 心 15 min ,取上 清 转 移 至 另 一 离 心 管 。 加 入 等 体 积 (500 L)异丙 醇 , - 20 沉 淀 过 夜 。 4 ,12 000 rp m 离 心 15min ,弃 上 清 ,75 %乙 醇 清 洗 一 次 ,再 用 无 水 乙 醇洗 一 次 ,室 温 干 燥 ,沉 淀 溶 于 15 L DEPC 水 中 。1. 2. 4 RNA 产 量 和 质 量 的 检 测(1) RNA 的 产 量 和 纯 度 检 测取 2 L 总 RNA 溶 液 ,加 入 DEPC 水 至 50 L
14、,用 Eppendorf Biop hotometer 紫 外 分 光 光 度计 测 定 RNA 的 浓 度 、 A260/ A280 和 A260/ A230的 比 值 。 A260/ A280 在 1. 8 2. 0、 A260/ A230大 于 2. 0 ,说 明 RNA 纯 度 比 较 好 。(2) RNA 的 完 整 性 检 测取 0. 5 L 总 RNA 溶 液 ,加 入 5. 5 L D EPC水 和 1 L 6 loading buffer , 电 压 10V/ cm , 1 %琼 脂 糖 凝 胶 ,电 泳 检 测 总 RNA。1. 2. 5 cDNA 第 一 链 合 成 及
15、LD2PCR 扩 增(1) cDNA 第 一 链 合 成参 照 Clontech 公 司 的 SMAR T cDNA 合 成说 明 书 进 行 :在 微 量 离 心 管 中 分 别 加 入 以 下 成 分 :总 RNA 1. 4 L (约 2. 0 g) ,SMA R T Oligonu2cleotide 1 L ,CDS primer 1 L ,用 DEPC 水 定容 至 5 L 。 72 温 浴 2 min ,然 后 置 冰 上 2 min ,离 心 ,再 加 入 5 First Buffer 2 L , D T T ( 20mmol/ L) 1 L ,dN TP Mix (10 mmol
16、/ L) 1 L ,Re2verse Transcriptase 1 L ,离 心 ,42 温 浴 1h ,然后 置 冰 上 终 止 反 应 。(2) cDNA 的 LD2PCR 扩 增在 微 量 离 心 管 中 分 别 加 入 以 下 成 分 : First2strand cDNA 3 L ,10 Advantage2PCR Buffer10 L ,MgCl2 (25 mmol/ L) 8. 0 L ,50 dN TP 2 L ,5PCR p rimer 2 L ,CDS primer 2 L , 50 Advantage polymerase mix 2 L ,加 水 定 容 至100 L
17、 。 PCR 扩 增 程 序 : 95 , 1 min ; 95 , 15sec ;68 ,3 min ; 30cycle。 取 5. 0 L PCR 产 物 ,1 %琼 脂 糖 电 泳 检 测 。1. 2. 6 cDNA 的 检 测利 用 条 锈 菌 中 与 孢 子 形 成 有 关 的 基 因 设 计 引物 SP1 ( ACCAAA TA TCCACAAA GA CCG2274 麦 类 作 物 学 报 第 27 卷CAA G) 、 SP2 ( GGCAA GAA GCCACTA GT T2GA GGTC) ,分 别 对 健 康 小 麦 cDNA、 条 锈 菌 cD2NA 以 及 受 条 锈
18、菌 侵 染 192 h 的 小 麦 叶 片 cDNA进 行 了 扩 增 。 扩 增 体 系 : 10 Buffer 2. 5 L ,MgCl2 (25 mmol/ L) 2. 0 L ,dN TP (10 mmol/ L )0. 5 L ,SP1 (10 mol/ L) 0. 5 L ,SP2 (10 mol/L) 0. 5 L , Taq DNA polymerase (MBI) 0. 3 L ,cDNA 20 ng ,用 水 补 充 至 25 L 。 PCR 程 序 :94 3 min ;94 50 s ;54 50 s ;72 1 min ;28cycles ;72 10 min ; 4
19、 forever。 PCR 产 物 用1. 5 %琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 。表 1 条 锈 菌 诱 导 的 小 麦 叶 片 总 RNA 提 取 方 法Table 1 Total RNA extraction protocols for rust induced wheat leaves步 骤StepsTrizol 法Trizol protocolLicl 法Licl protocolSDS 法SDS protocolBizol 法Bizol protocol加 入 提 取 缓 冲 液Add extraction buff2er1mL Trizol1 mL (100 mM Licl
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- 锈菌 诱导 小麦 叶片 RNA 提取 方法 比较 LD2PCR
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