病理科免疫组织化学技术员培养训练及技术操作规范设计.doc
《病理科免疫组织化学技术员培养训练及技术操作规范设计.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《病理科免疫组织化学技术员培养训练及技术操作规范设计.doc(12页珍藏版)》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。
1、.病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范一、病理科免疫组织化学技术员培训规范:凡新入我科的病理技术员均需进行免疫组化理论知识的学习、培训,经考核合格、具备病理技术员技士资质后方能从事免疫组织化学染色。二、病理科免疫组织化学染色操作规范1.免疫组织化学染色前的准备事项(一)组织切片的制备常规切片脱蜡至水(组织固定需用 10%中性甲醛) (二)抗体的选择、稀释和保存(1)选择抗体应先了解其反应谱和适用条件包括适用切片(石蜡切片抑或冷冻切片)、稀释度和温育时间等。(2)对于未曾使用过的新抗体,应按照有关说明书的提示,以几个不同的稀释度对适宜检材(已知阳性切片/涂片)进行预试验;根据染色阳性表达的
2、程度和检材背景着色程度,确定用于染色的最适稀释度(3)抗体的原液应于分装后置于一 20冷室中保存,切勿反复冻存(以免效价 降低)。(4)抗体的工作液可置于 4冰箱中保存。(5)抗体的稀释。(1)一般用 0.01M PBS(生理盐水磷酸盐缓冲液),pH 值 7.2。(2)或用 0.05M TBS(生理盐水三经基氨基甲烷缓冲液),pH 值 7.6。(3)必要时可按需要加适量小牛血清清蛋白。(三)被检测组织内抗原的修复(1)经 4%中性甲醛之类含醛基固定剂固定的组织,其切片中的抗原决定簇因醛的交联作用而被封闭,从而影响抗原一抗体反应。进行免疫组织化学染色前,对于组织切片进行抗原修复处理,会使组织中的
3、固有抗原尽量多地暴露出来,提升了大部分检测抗体的阳性率和反应强度。有的抗体不需要进行抗原修复。应按抗体试剂说明书的提示决定是否进行被检测组织内的抗原修复。(2)抗原修复缓冲液。(l)一般为 0.01M 柠檬酸缓冲液(2.1g 柠檬酸溶于 100ml 蒸馏水中,用 2M NaOH 调节 pH 值至 6.0)。(2)有些抗体需要特殊修复缓冲液,如高 PH 值的 EDTA(50mM Tris.,10mM EDTA,pH9.0),或商品化的该高 pH 修复液等。(3)抗原修复的常用方法。.(l)胰蛋白酶消化法: 组织切片脱蜡、水化。滴加一滴 0.1%胰蛋白酶液于组织切片上。37下温育 20-40min
4、(温育时间取决于组织经 4%中性甲醛固定时间的长短和被检测抗原)。蒸馏水冲洗,终止反应。阻断内源性过氧化物酶。进行免疫组织化学染色。(配制 0.1%胰蛋白酶液时,应将 0.1g 胰蛋白酶溶于 0.1%无水氯化钙水溶液(pH 值 7.8)中。)(2)胃蛋白酶消化法:组织切片脱蜡、水化.滴加胃蛋白酶工作液于组织切片上。37下温育 10-30min(一般为 10min,可延至 30min,取决于组织经 4%中性甲醛固定时间的长短).浸人蒸馏水,终止反应。进行免疫组织化学染色。用 1%胰蛋白酶液 37下处理 20min。(应以 0.1M HCI 配制胃蛋白酶工作液。过度的胃蛋白酶消化会使组织结构破坏、
5、切片 脱落。)(3)微波修复抗原法:组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。将组织切片置于容器(塑料盒或玻璃缸)中,并向其中加人抗原修复液 200ml,盖上具有小孔的盖子。将该容器置于微波炉(705-800W)中央加热(95)5min,2 次(于两次之间,应向容器中添加蒸馏水50ml,严防组织切片干燥)。将该容器移出微波炉,置于室温下冷却 15-20min。蒸馏水冲洗。阻断内源性过氧化物酶,而后将切片置于蒸馏水中。用 TBS 或 PBS 液冲洗。进行免疫组织化学染色。(4)热水浴法:组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。向装组织切片的容器加人足量(例如 200ml
6、)抗原缓冲液,置于水浴锅中,加热至 95 -99(不沸腾)预热。.将组织切片插人已预热的容器内,温育 20-40min。将该容器由微波炉移出,置于室温下冷却 20min。 室温下,用 TBS、PBS 或水洗。蒸馏水冲洗。阻断内源性过氧化物酶,而后将切片置于蒸馏水中。用 TBS 或 PBS 液冲洗。进行免疫组织化学染色。(5)压力锅法:组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。向 4-5.5L 的不锈钢压力锅中加人抗原修复缓冲液(约为锅容积的 2/3), 不加阀情况 下加热至沸腾。将组织切片插放于金属切片架上,并置于压力锅内沸腾的缓冲液中。加阀情况下,将组织切片加压 2min。压力锅
7、自行冷却或以流水冷却减压后,持续 20min。将冷却后的切片取出,蒸馏水冲洗后,置于 TBS 或 PBS 液中(以免组织切片干燥)。蒸馏水冲洗。阻断内源性过氧化物酶,而后将切片置于蒸馏水中。用 TBS 或 PBS 液冲洗。进行免疫组织化学染色。(四)组织切片中内源性酶的阻断1.内源性过氧化物酶 主要存在于红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞了嗜酸性粒细胞和组织内。阻断方法:最常用 0.3%-0.5%H2O2-甲醇液,作用 15-30min, 阻断液必须使用时新鲜配制。由于阻断内源性过氧化物酶常同时导致被测抗原变性(使特异性着色减弱),而大部分组织不含有内源性过氧化物酶,所以阻断内源性过氧化物酶一般不
8、必作为常规步骤。必须阻断内源性过氧化物酶时,可安排在第一抗体反应后进行,以减少抗原的破坏。2.内源性碱性磷酸酶 主要存在于嗜中性粒细胞和内皮细胞。阻断方法:应用 1M 左旋咪唑,作用 15-30min。3.内源性生物素 肝、胰、肾等的细胞内含有多量生物素或类生物素物质。 阻断方法:先将切片浸于卵白素(0.5g/ml)中 15min,以缓冲液洗净后,移浸于生物素饱和溶液中 15min,再用缓冲液洗去多余的生物素饱和液;也可应用商供的阻断试剂盒(按说明书操作)。.(五)正常血清保护作为检测试剂的抗体蛋白带有一定的负电荷,免疫组织化学染色时,易与带有正电荷的组织特别是纤维组织、变性和(或)坏死的细胞
9、、嗜酸性粒细胞等发生静电吸引而导致非特异性染色。去除这种非特异性染色最有效的方法是,在滴加第一抗体前,先滴加用于制备第二抗体动物的非免疫血清或是滴加除制备第一抗体动物以外的其他动物非免疫血清,浓度为 1:5-1:20;必要时可滴加 2%-5%牛 血清清蛋白。正常血清保护作用时间 10-20min。用于阻断非特异性结合的血清不能有明显的溶血。(六)缓冲液用于稀释抗体,洗涤切片的缓冲液主要有两种。1.TBS(0.05M,pH7.6),Tris 一 HCl 缓冲液(0 .SM,pH 7.6) 100ml8 .5%NaCl 100ml蒸馏水加至 1000mlTris 一 HCI 缓冲液(0 .5M,p
10、H7.6)三经甲基氨基甲烷(Tris) 61gHCl 37ml蒸馏水加至 1000ml2PBS(0 .IM,pH 7.6) Na2 HPO4 12H2O2 29gNaH2PO4 2H2O 3gNaCl 85g蒸馏水加至 1000ml使用时用蒸馏水稀释 10 倍即成 0.0lM。二、免疫组织化学染色常用方法(一)直接法1.脱蜡和水化。2.3%过氧化氢或 0.5%过氧化氢甲醇液,5min。 3.TBS 或 PBS 缓冲液洗涤。4.抗原修复。5.无关动物正常血清(适当稀释)20-30min。6.甩去正常动物血清,滴加适当稀释的辣根过氧化物酶标记抗体,或增强的酶标多聚物一步法.(Enhanced Po
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 理科 免疫 组织化学 技术员 培养 训练 技术 操作 规范 设计
限制150内