间接ELISA检测抗血清效价.doc
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1、|间接 ELISA 检测抗血清效价姓名:王贤臣 学号:1125400080(成都医学院 医学检验 成都 610500)【摘要】目的:通过实验掌握间接酶联免疫吸附测定技术(ELISA)的原理及操作过程及间接 ELISA 检测抗血清效价的实验条件优化及效价的确定。方法:间接 ELISA 双抗体夹心法对包被抗原及酶标抗体工作浓度进行探索。结果:经过预实验初步确定抗人白蛋白血清包被浓度和一二抗的浓度,然后在正式实验确定其浓度,从而再进行研究。讨论:间接 ELISA 检测抗血清效价的影响因素。并将预实验方法的结果与确定实验的结果进行对比,和分析在实验过程中的注意事项。【关键词】抗人白蛋白 ABL ELI
2、SA 前言:1971 年 Engvall 和 Perlmann 发表了酶联免疫吸附测定用于 IgG 定量测 定的文章,使得 1966 年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展为体液标本中微量物质的测定方法。之一方法的基本原理是:使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持器免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原后抗体即保留其免疫活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加
3、入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。由于酶的催化频率很高,故可极大的放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。实验方法:预实验设计方案:1、 材 料 与 方 法1.1 仪器:洗板机(BIO-RAD MODEL 1575 )SM 自动化酶免疫分析仪(北京天石医疗用品制作所 BIO-RAD 680)电热恒温箱(上海恒科技仪器有限公司)移液枪(上海求精生化试剂仪器有限公司)微孔反应板 刻度吸管 (5ml、1ml) 吸耳球 试管架 塑料试管 封口纸 烧杯1.2 试剂:人 ALB 标准品(SIGMA :A1653 S
4、IZE:250MG storage:2-8)PBS 缓冲液:0.1M pH7.4(PBS 1L 配方 pH7.4:磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g,十二水水磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)3.58g,氯化钠(NaCl)8.0g,氯化钾(KCl)0.2g,加水至 1000mL) 包被液:0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液 洗涤液:0.05%Tween-PBS(即 PBST) (0.05%Tween-PBS 1000mlPBS加 500ul 吐温) |封闭液:1%干酪素-PBST(1%酪蛋白溶液 100mlPBS 加 1g 干酪素) 显色液(A 液、B 液 Cat:ME002 可溶性
5、TMB 显色液) 终止液:2M H2SO4 酶标抗体(兔抗羊-HRP,武汉博士德生物工程有限公司)1.3 待测标本:羊抗人 ALB(效价 1:70 批号:201106 贮存于 4-20,有效期:2 年) 1.4 方法: 预 实 验包 被 抗 原 (100ul/孔 ) 4 过 夜 或 37 2h 洗 涤 3 次 拍干加 封 闭 液 (300ul/孔 ) 4 过 夜 或 37 2h 洗 涤 3 次 拍干加 入 标 本 (100ul/孔 ) 37 1h 洗 涤 5 次 拍干加 入 酶 标 抗 体 (100ul/孔 ) 拍干 37 1h 洗 涤 5 次加 入 显 色 剂 A、 B 液 各 50ul/孔
6、 37 15-20min加 入 终 止 液 (100ul/孔 )检 测表 1: 包 被 抗 体 和 酶 标 记 抗 体 棋 盘 滴 定羊抗人 ALB 血清 羊抗人 ALB 血清兔抗羊IgG-HRP1:101:401:1601:6401:2560PBS兔抗羊IgG-HRP1:101:401:1601:6401:2560PBS1:500 1:5001:2000 1:20001:8000 1:80001:16000 1:16000羊抗人 ALB 血清 羊抗人 ALB 血清兔抗羊IgG-HRP1:101:401:1601:6401:2560PBS兔抗羊IgG-HRP1:101:401:1601:640
7、1:2560PBS1:500 1:5001:2000 1:20001:8000 1:80001:160001:16000( 1) 将 人 ALB 用 包 被 液 稀 释 为 :人ALB:10ug/ml人ALB:1ug/ml人ALB:0.1ug/ml人 ALB 0.01ug/ml|0.01ug/ml 0.1ug/ml 1ug/ml 10ug/ml( 2) 酶 标 结 合 物 ( 兔 抗 羊 IgG-HRP) 稀 释 为 :1:500 1:2000 1:8000 1:16000( 3) 抗 人 白 蛋 白 血 清 ( 羊 抗 人 ALB 血 清 ) 稀 释 为 :1:10 1:40 1:160 1
8、:640 1:2560在 初 步 结 果 的 基 础 上 继 续 细 化 工 作 浓 度 , 重 新 检 测 以 确 定 最 终 最 适 包 被 抗原 和 酶 标 抗 体 的 最 终 工 作 浓 度 , 即 建 立 间 接 ELISA 法 检 测 抗 人 白 蛋 白 血 效 价 。 正 式包 被 抗 原 (100ul/孔 ) 4 过 夜 或 37 2h 洗 涤 3 次 拍干加 封 闭 液 (300ul/孔 ) 4 过 夜 或 37 2h 洗 涤 3 次 拍干加 入 标 本 (100ul/孔 ) 37 1h 洗 涤 5 次 拍干加 入 酶 标 抗 体 (100ul/孔 ) 拍干 37 1h 洗
9、涤 5 次加 入 显 色 剂 A、 B 液 各 50ul/孔 37 15-20min加 入 终 止 液 (100ul/孔 )检 测表 2: 包 被 抗 体 和 酶 标 记 抗 体 棋 盘 滴 定包 被 抗 原 的 浓 度 为 0.1ug /ml 0.01 ug /ml, 每 个 浓 度 做 三 排 , 共 做 六 排 , 测 出OD 值羊抗人 ALB 血清兔抗羊IgG-HRP1:10 1:40 1:1601:6401:25601:102401:40960PBS1:80001:100001:16000羊抗人 ALB 血清兔抗羊IgG-HRP1:10 1:40 1:1601:6401:25601:
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