黄连、萸黄连标准饮片制备技术规范及其主要成分抗肿瘤活性研究-李蒙.pdf

学 号： 1431800253 硕 士 学 位 论 文 MASTER DISSERTATION 黄连、萸黄连标准饮片制备技术规范及其主要成分抗肿瘤活性研究 The technical specification to produce Coptidis Rhizoma and Euodiae Fructus-Coptidis Rhizoma standard pieces and studies on antitumor effect of their main constituents 研 究 生 姓 名 ： 李 蒙 指导教师姓名、职称 ： 王光忠 教授 刘焱文 教授 申 请 学 位 ： 医学硕士 学 科（专业）名 称 ： 中药学 研 究 方 向 ： 中药炮制工艺及其质量标准研究 学 位 类 型 ： 学术学位 湖 北 中 医 药 大 学 二 ○ 一 七 年 五 Hubei University of Chinese Medicine 万方数据 万方数据 湖北中医药大学学位论文原创性声明 本人声明： 所呈交的学位论文是在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖北中医药大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 年 月 日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解湖北中医药大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部份内容，可以采用复印、缩印或其他手段保留学位论文；学校可以根据国家或湖北省有关部门的规定送交学位论文。同意《中国优秀博硕士论文全文数据库出版章程》的内容。同意授权中国科学技术信息研究所将本人学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。 （保密论文在解密后遵守此规定） 论文作者签名： 导师签名： 年 月 日万方数据 目 录 中文 摘要 I Abstract III 缩略词表 VII 前 言 1 第一章 黄连、萸黄连标准饮片制备工艺研究 . 3 第一节 黄连药材采收加工方法考察及质量研究 . 3 1 黄连药材采收加工 . 3 2 黄连药材质量检测 . 5 第 二节 黄连、萸黄连饮片的制备及质量检测 . 8 1 仪器与试药 . 9 2 方法与结果 . 9 3 讨论 18 第三节 黄连、萸黄连饮片标准饮片制备工艺研究 19 1 仪器与试药 20 2 方法与结果 20 3 讨论 37 第二章 黄连、萸黄连标准饮片质量技术研究 39 第一节 黄连标准饮片质量标准研究 39 1 仪器与试药 39 2 方法与结果 40 3 讨论 44 第二节 萸黄连饮片质量标准研究 44 1 仪器与试药 44 2 方法与结果 45 万方数据 3 讨论 48 第三章 黄连、萸黄连标准饮片指纹图谱研究 50 第一节 黄连标准饮片的指纹图谱研究 50 1 仪器与试药 50 2 方法与结果 50 3 讨论 61 第二节 萸黄连标准饮片指纹图谱研究 62 1 仪器与试药 62 2 方法与结果 62 3 讨论 72 第四章 黄连、萸黄连标准饮片制备技术规范及质量标准草案 74 第一节 黄连、萸黄连标准饮片制备技术规范草案 74 第二节 黄连标准饮片质量标准 76 第三节 萸黄连标准饮片质量标准 79 第五章 黄连、萸黄连主要成分抗肿瘤活性研究 82 1 材料与方法 . 82 2 实验方法 83 3 结果与讨论 . 84 结语与创新 . 88 附录 . 90 文献综述 . 91 参考文献 106 致 谢 111 万方数据 万方数据 I 中文摘要 黄连是我国常用传统中药，其药用部位为 毛茛科植物黄连 Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连 Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao 或云连 Coptis teeta Wall.的 干燥根茎，药材分别称为“味连”“雅连”和“云连”。 味连主产于湖北、重庆等地 ，产量大、质量好，其中 湖北恩施利川味连年产量 约 占全国产量的 50%。 黄连始载于《神农本草经》，列为上品， 收载于历年版《中国药典》一部，具有清 热 燥湿 、 泻火解毒之功效，用于湿热痞满，呕吐吞酸，高热神昏，心火亢盛，心烦不寐，心悸不宁，痈肿 疔 疮等病症。 黄 连 炮制时因加辅料不同 有 黄连、酒黄连、姜黄连 和 萸黄连 4种饮片 之分 ， 并具有不同的 其功效 作用，但 4种饮片标准主要借用黄连药材标准，缺乏饮片专属性质量标准，导致其 饮片 质量难以控制、严重影响了临床疗效和用药安全。 另一方面， 由于中药饮片成分和炮制机制的复杂性， 当前 采用化学对照品、对照药材 等 标准物质的质量评价方法无法反映中药饮片的科学内涵和特征属性，特别是对于熟饮片 。 中药标准饮片是用来评价饮片质量最合适的“标准物质” ，具有 专属性强 、经济、 获取方便、 应用广泛等优点 。因此，开展中药标准饮片作为中药饮片质量评价标准体系中标准物质的基础研究具有非常重要的科学意义和实用价值。 本学位论文通过对黄连和萸黄连标准饮片的制备工艺，质量标准，指纹图谱进行系统研究，并对其主要有效成分抗肿瘤生物活性进行了初步研究，以期规范黄连和萸黄连 标准 饮片的制备工艺，完善其质量控制标准和阐释其药效物质基础 ，为黄连、萸黄连标准饮片的生产及其应用提供科学依据。 1.黄连 、 萸黄连 原形 饮片制备工艺研究 通过对黄连文献调研和实地调研，选择味连为制备黄连及萸黄连标准饮片的原料，确定了味连道地产区，考察了味连产地加工方法，制定了原料药材的采集加工技术规范； 在黄连和萸黄连饮片的传统制备工艺基础上，对其净制 、 软化 、 切制 、 干燥 、 筛选等工艺程序进行了 规范 ，确定了 技术参数，进行了批量制备， 为制备黄连和萸黄 连标准饮片提供万方数据 II 了 原料饮片 。 2.黄连、萸黄连 标准饮片的均匀化技术规范 研究 采用高效液相色谱法等现代分析方法对不同粉碎方式及粒度的黄连、萸黄连质量进行综合分析，确定了其均匀化方法 ； 采用薄层色谱法、高效液相色谱法等现代分析方法开展了环境因素对黄连、萸黄连标准饮片质量的影响研究 ， 为标准饮片的粒度选择提供科学依据。 3.黄连，萸黄连标准饮片质量标准研究 参照 2015 年版《中国药典》一部收 载黄连的质量标准，对黄连和萸黄连标准饮片的性状 、 薄层鉴别 、 检查（水分 、 总灰分） 、 浸出物 、 含量检测等项进行了研究，分别制 订 较完善的质量标准，能有效控制黄连，萸黄连标准饮片的质量。 4.黄连 、 萸黄连标准饮片 指纹图谱 研究 参照国家食品药品监督管理总局颁布的“中药注射剂指纹图谱”相关技术要求，分别制定黄连和萸黄连标准饮片的指纹图谱。黄连的指纹图谱标示 15 个共有峰， 萸黄连的指纹图谱标示了 18 个共有峰，能有效评价 黄连、萸黄连 的质量。 5.拟定 黄连 、 萸黄连标准饮片制备 技术规范 及质量标准草案 参照相关中药饮片制备工艺和质量标准的研究资料，对黄连和萸黄连标准饮片的制备工艺和质量标准的研究结果进行了总结。规范了黄连和萸黄连标准饮片的制备工艺 、 拟定了质量标准草案，从而为两 种 标准饮片的 生产及 推广应用奠定了良好基础。 6.萸黄连中主要成分抗肿瘤活性筛选研究 采用现代分子生物学研究方法，对萸黄连主要有效成分小檗碱和吴茱萸碱进行了抗肿瘤生物活性研究，表明两者均具有抑制肿瘤细胞增殖作用 ，且 小檗碱对 HepG2细胞活性强。 这对于阐释其药效物质基础具有一定意义。 主题词： 黄连 ； 萸黄连 ； 标准饮片 ； 制备技术 ； 质量标准 ； 指纹图谱 ；抗肿瘤活性 万方数据 III Abstract Coptis is commonly used in traditional Chinese medicine,The medicinal parts for the Ranunculaceae plants Huanglian dry rhizome, medicinal materials were called“yunlian”“yalian”and“weilian”.Taste mainly produced in Hubei, Chongqing and other places, large output, good quality, which Hubei Enshi Li Chuan“weilian”output accounts for about 50% of the national output.Huang Lian was included in the “Shen Nong s Materia Medica“, as the top grade, included in the calendar year version of “Chinese Pharmacopoeia“ one, with heat dampness, Xiehuo detoxification effect, for hot and humid fullness, vomiting, , Firelight Kang Sheng, upset insomnia, palpitations restless, carbuncle swollen boils and other illnesses.Huang Lian concocted due to add different materials have huanglian 、 yuhuanglian 、 jianghuanglian and jiuhuanglian four different Rhizoma.And has a different effect of its effect,But the four kinds of Pieces standard mainly use Huanglian herbal medicine standard, the lack of specific quality standards for Pieces, resulting in its quality of Pieces difficult to control, seriously affecting the clinical efficacy and drug safety.On the other hand, due to the complexity of Chinese herbal medicine composition and processing mechanism, the current use of chemical reference materials, control herbs and other standard material quality evaluation methods can not reflect the scientific connotation and characteristics of traditional Chinese medicine Pieces, especially for cooked Pieces.Traditional Chinese medicine standard Pieces is used to evaluate the quality of the most appropriate “standard material“, with an economic, easy access, widely used and so on.Therefore, it is of great scientific and practical value to carry out traditional Chinese medicine standard Pieces as the basic research of standard material in standard system of quality evaluation of traditional Chinese medicine Pieces.In this paper, Through the Coptidis Rhizoma standard pieces and Euodiae Fructus-Coptidis Rhizoma standard pieces by Preparation technology, quality standards, fingerprints for systematic research,And the main active ingredients of anti-tumor biological activity of a preliminary study,In order to standardize the preparation process of Coptidis Rhizoma standard pieces 万方数据 IV and Euodiae Fructus-Coptidis Rhizoma standard pieces, improve its quality control standards and explain the basis of its efficacy material, for the Coptidis Rhizoma standard pieces and Euodiae Fructus-Coptidis Rhizoma standard pieces production and its application to provide a scientific basis. 1.Study on Preparation Technology of Coptidis Rhizoma and Euodiae Fructus-Coptidis Rhizoma Through the research and field investigation of Coptis chinensis,Select weilian for the preparation of Coptidis Rhizoma and Euodiae Fructus-Coptidis Rhizoma standard pieces raw materials, identified weilian Road real estate,weilian method of processing and processing of raw materials and medicinal materials was established.； On the basis of the traditional preparation process of Coptidis Rhizoma and Euodiae Fructus-Coptidis Rhizoma,The specification of the process, such as netting, softening, cutting, drying and screening, has been carried out to determine the technical parameters,Preparation of raw materials for the preparation of Coptidis Rhizoma standard pieces and Euodiae Fructus-Coptidis Rhizoma standard pieces 2.Study on the Technical Standard of Coptidis Rhizoma standard pieces and Euodiae Fructus-Coptidis Rhizoma standard pieces The quality of huanglian、 yuhuanglian in different crushing methods and particle size was analyzed by modern analytical method such as high performance liquid chromatography (HPLC) ， And the method of homogenization was determined. The influence of environmental factors on the quality of Coptidis Rhizoma standard pieces and Euodiae Fructus-Coptidis Rhizoma standard pieces was studied by thin layer chromatography and high performance liquid chromatography (HPLC), which provided scientific basis for the selection of standard tablets. 万方数据 V 3.Study on Quality Standard of Coptidis Rhizoma standard pieces and Euodiae Fructus-Coptidis Rhizoma standard pieces (Water, total ash), extract, content detection and other items were studied according to the quality standard of Huanglian contained in the Chinese Pharmacopoeia of 2015, and the quality of Coptidis Rhizoma standard pieces and Euodiae Fructus-Coptidis Rhizoma standard pieces was improved. Standard, can effectively control the quality of Coptidis Rhizoma standard pieces and Euodiae Fructus-Coptidis Rhizoma standard pieces . 4.Study on Fingerprint of Coptidis Rhizoma standard pieces and Euodiae Fructus-Coptidis Rhizoma standard pieces Reference to the State Food and Drug Administration promulgated the “Chinese medicine injection fingerprints“ related technical requirements, respectively, the development of Coptidis Rhizoma standard pieces and Euodiae Fructus-Coptidis Rhizoma standard pieces fingerprints. Huanglian fingerprint of 15 common peaks, Yuhuanglian fingerprints marked 18 common peaks, can effectively evaluate the quality of Coptidis Rhizoma standard pieces and Euodiae Fructus-Coptidis Rhizoma standard pieces. 5.Preparation of Coptidis Rhizoma standard pieces and Euodiae Fructus-Coptidis Rhizoma standard pieces preparation of technical specifications and quality standards draft According to the research data of the preparation process and quality standard of Chinese medicinal Pieces,The results of the preparation process and quality standard of Coptidis Rhizoma standard pieces and Euodiae Fructus-Coptidis Rhizoma standard pieces were summarized.Standardized the preparation process of Coptidis Rhizoma standard pieces and Euodiae Fructus-Coptidis Rhizoma standard pieces, developed a draft quality standards, Which for the two standard Pieces of production and application of the application has laid a good foundation. 万方数据 VI 6.Study on Antitumor Activity Screening of Main Ingredients in Coptidis Rhizoma and Euodiae Fructus-Coptidis Rhizoma The antitumor biological activity of berberine and evodiamine was studied by using modern molecular biology research method, which indicated that both had inhibitory effect on tumor cell proliferation and that of berberine was highly active against HepG2 cells. This is for the interpretation of its pharmacological material basis has a certain significance. Key word： Coptis chinensis Franch ； Standard Pieces；Preparation technology； Fingerprints； Antitumor activity 万方数据 VII 缩略词表 英文缩写 中文释义 HPLC TLC RSD HepG 2 MgC 803 A549 PBS FBS SDS DMSO MTT 高效液相色谱 薄层色谱 相对标准偏差 人 肝 癌细胞株 人 胃癌细胞株 人肺腺癌细胞株 磷酸盐缓冲液 胎牛血清 十二烷基硫酸钠 二甲基亚砜 3-（ 4， 5-二甲基噻唑 -2） -2， 5-二苯基 四氮唑溴盐 万方数据黄连、萸黄连标准饮片制备技术规范及其 主要 成分抗肿瘤活性研究 1 前 言 中药包括中药材、中药饮片、中成药三大部分；中药材种植养殖 、中药饮片炮制及中成药生产为中药行业三大支柱产业。中药材生产是第一产业，中成药生产是第二产业，中药饮片是中药工业、农业、临床应用的交汇点，是中药产业链的关键节点 。 《中国药典》 2010 年版凡例中对“中药饮片”作出了明确的定义 :“饮片系指药材经过炮制后 可直接用于中医临床或制剂生产使用的处方药品” 。 因此，中药饮片的炮制加工及其质量的优劣直接影响着中药产业的发展和中医临床用药的安全性和有效性，而饮片生产的规范化和饮片产品的标准化将成为整个中医药行业规范化的关键。 中药饮片据“依法炮制”而制备，饮片质量据“生熟有定”而评价。由于中药饮片成分和炮制机制的复杂性，当前采用化学对照品、对照药材等标准物质的质量评价方法无法反映中药饮片的科学内涵和特征属性，特别是对于 熟饮片 。中药标准饮片是用来评价饮片质量最合适的“标准物质”。标准饮片较之单一化学成分对照品可提供更多的饮 片属性信息，较以单体化学成分作为对照品具有更大的饮片属性信息，可以较为全面地展示饮片内在质量，提高饮片真伪鉴别、质量优劣评价的可靠性和专属性，同时可弥补化学对照品匮乏之不足。因此，开展中药标准饮片作为中药饮片质量评价标准体系中标准物质的基础研究具有非常重要的科学意义和实用价值。 中药标准饮片是用来控制相应中药饮片质量的对照物质。 其 技术要求 主要有 ① 原料药材基原确定、采集 加工 方法合理 ， 具备完整的身份信息 ； ② 原形 饮片 及其标准饮片 采用规范化炮制工艺制备 ， 具备完整的制备过程信息 ；③原形饮片及其标准饮片质量标准完善、稳定可控；④包装、贮藏保管方法科学合理等。本论文据此对黄连、萸黄连标准饮片的制备技术规范 开展 系统研究。 万方数据 2 黄连是我国常用传统中药，具有清燥湿，泻火解毒之功效 。 《中国药典》 2015 版 一部 收载有 黄连、酒黄连、姜黄连、萸黄连 4 种饮片，其功效因炮 制方法的不同 而 有所 区别： 黄连生用苦寒性较强，长于泻火解毒，清热燥湿；酒炙黄连能引药上行，缓其寒性，善清头目之火；姜炙黄连缓和苦寒之性，并增强其止呕作用，以治胃热呕吐为主；吴萸制黄连抑制其苦寒之性，使黄连寒而不滞，以清气分湿热，散肝胆郁火为主。4 种饮片标准主要借用黄连药材标准，缺乏饮片专属性质量标准，导致其质量难以控制、严重影响了临床疗效和用药安全。 鉴于上述存在的问题，本论文对黄连和萸黄连标准饮片的制备工艺 、质量标准和指纹图谱进行了系统研究，取得了良好研究结果，从而为 2种 中药标准饮片的 生产及 推广应用奠定了一定基础，并对萸黄连的主要有效成分进行了抗肿瘤生物活性研 究，这对于阐释其药效物质基础具有一定意义。 本论文 获得 国家科技部科技基础性专项 (2014FY111100-2)资助，其研究内容为该专项研究工作的组成部分。 万方数据黄连、萸黄连标准饮片制备技术规范及其 主要 成分抗肿瘤活性研究 3 第一章 黄连、萸黄连标准 饮片 制备工艺 研究 第一节 黄连药材采收加工方法考察及质量检测 1 黄连药材采收加工方法 根据文献调研（见综述部分“黄连品种来源及其道地产区”）结果，实验选用味连 Coptis chinensis Franch.，药材采集地为道地产区湖北利川、重庆石柱县。课题组于 2015 年 11 月 3 至 4 日赴重庆市石柱县黄水镇考察黄连采收及产地加工情况。 黄连药材以秋末采挖为佳；栽培黄连一般生长 4～ 5 年，于 9～ 11 月采收。选晴天挖出全株，除去泥土，剪去叶片，收集根茎 ， 运回加工。 当地主要于烘房烘干（黄连药材放入滚筒中加热风干）。烘干时火力不宜过大， 60℃～ 70℃，转动速度为 10～ 15 转 /分，烘 6h 左右，取出。挑选出未干者，继续风干。此种干燥方法在干燥的同时，通过旋转可以撞去残存须根、粗皮、鳞芽及叶柄、石子、土粒等。生产流程 见图 1。 图 1 产地加工工艺流程 采挖 剪 去叶 挑 选 干 燥 包 装 检验 未干者需继续干燥 去泥沙 烘干：温度 60℃～ 70℃，转速 10～ 15 转 /分，时间6h左 右。 万方数据湖北中医药大学 2017 硕士学位论文 4 根据课题要求，此次采收的品种为味连，共采收三批，第一批于2015 年 11 月 9 日采自于重庆石柱县黄水镇（移栽 5 年 ） （ 20151109），第二批 2015 年 10 月 22 日采自于湖北省利川市忠路镇（移栽 5 年）（ 20151022），第三批 2015 年 10 月 23 日采自于湖北省利川市建南镇（移栽 5 年）（ 20151023）。三批药材的重量分别为 18.5 kg（黄水）、21.0kg（忠路）、 20.5kg（建南）。 黄连药材采收加工见图 2。 图 2 黄连药材产地加工过程图 1.种植地； 2.采挖； 3. 除去泥土、剪去叶片； 4.收装； 5.待干燥品； 6.烘房； 7.装药口； 8.滚筒； 9. 挑选（未干者需再烘） ； 10. 黄水药材（石柱）； 11. 忠路镇药材（利川）； 12. 建南镇药材（利川） 1 7 6 5 4 2 3 12 11 10 9 8 万方数据黄连、萸黄连标准饮片制备技术规范及其 主要 成分抗肿瘤活性研究 5 2 黄连药材质量检测 2.1 仪器与试药 仪器： Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦）， GZX-9146 MBE 数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）， XSE105DU十万分之一分析天平（瑞士 METTLER TOLEDO 公司）， AL204 万分之一电子天平（梅特勒 -托利多仪器有限公司）， CX-200 型高速多功能粉碎机（上海缘沃工贸有限公司）。 SK7200HP 超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）， SX-2 马福炉（上海跃进医疗器械厂）；高效薄层板（月旭）。 试药： 盐酸小檗碱（批号 Y11A6W1）、表小檗碱（批号 H25F3X1）、黄连碱（批号 Z24F4B1） 和 巴马汀（批号 ZM0520XA14） 均购自 上海源叶生物科技有限公司） ， 乙腈、甲醇（美国 Tedia 公司）为色谱纯，纯净水（娃哈哈纯净水），盐酸、磷酸二氢钾、十 二烷基硫酸钠、磷酸、环己烷、乙酸乙酯、异丙醇、三乙胺等均为分析纯。 2.2 方法与结果 2.2.1 黄连药材的薄层鉴别 取黄连药材，粉碎（二号筛），得供试品。称取黄连粉末 0.25g，加入甲醇 25ml，密塞，超声处理 30min，过滤，取续滤液作为供试品。另取黄连对照药材粉末 0.25g，同法制成对照药材溶液。称取盐酸小檗碱对照品，加入甲醇制成每 1ml 含 0.5mg 作为对照品溶液。按照 2015 版《中国药典》通则 0502 进行薄层色谱鉴别，用高效硅胶 G 薄层板 ,点样量为 1µl ， 用 环 己 烷 - 乙 酸 乙 酯 - 异 丙 醇 - 甲醇 - 水 - 三 乙 胺 (3:3.5:1:1.5:0.5:1) 作为展开剂 ， 置 用 浓氨试液预饱和 氨水预饱和20min； 展开，取出，晾干，置紫外光灯 (365nm)下检视。 结果见图 3。 万方数据湖北中医药大学 2017 硕士学位论文 6