猪用生物制品及相关猪源原辅材料中非洲猪瘟病毒核酸检测方法.docx
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1、附件猪用生物制品及相关猪源原辅材料中非洲猪瘟病毒核酸检测方法1 适用范围1.1 猪用及采用猪源原辅材料制备的生物制品成品及半成品。1.2 猪源毒种。 1.3 猪源细胞及相关制品生产用细胞。1.4 其他猪源原辅材料(如组织、血清、胰酶衍生物等) 。2 取样和处理2.1 疫苗2.1.1 活疫苗 取至少 2 瓶样品,按瓶签注明头份用适宜稀释液分别稀释成 10 头份/0.2ml,等量混合,取混合液进行核酸提取。2.1.2 灭活疫苗 取至少 2 瓶样品,等量混合后进行以下处理。2.1.2.1 油佐剂灭活疫苗 取 36 ml 混合疫苗,加入正戊醇 4.0 ml,充分振荡混合 1 分钟,28冰箱静置不少于
2、60 分钟,直至油相和水相分离。取水相进行核酸提取。2.1.2.2 水性佐剂灭活疫苗2.1.2.2.1 铝胶佐剂灭活疫苗 取混合疫苗 5.0 ml,摇匀,加入0.25 g 解离剂 CPG-odn(人工合成的寡聚核苷酸) ,放入摇床(200 r/min)37解离 1 小时,5000 r/min 离心 10 分钟,取上清液进行核酸提取。2.1.2.2.2 其他水性佐剂灭活疫苗 直接取混合样品进行核酸提取。2.2 其他生物制品和半成品冻干类制品,按活疫苗进行取样和处理;液体制品及半成品,取至少 2 份(瓶)样品,等量混合,取混合液进行核酸提取。2.3 猪源毒种 取至少 2 支毒种。冻干毒种,按冻干前
3、体积复溶后等量混合,取混合液进行核酸提取;非冻干毒种,等量混合后直接取混合液进行核酸提取。2.4 猪源细胞 除另有规定外,取至少 2 瓶细胞浓度不少于107.0个细胞/ml 的细胞悬液进行核酸提取。2.5 其他猪源原辅材料2.5.1 猪组织 每种组织,分别取样和处理。取不少于 2.0 g 组织,研磨后用 5 倍体积灭菌 PBS 悬浮,70灭活 30 分钟,4下以20003000 g 离心 10 分钟,取上清液进行核酸提取。2.5.2 猪血清 每批血清取至少 2 个最小包装的样品,等量混合,取混合液进行核酸提取。2.5.3 猪胰酶 干粉状胰酶,取至少 2 份样品,根据使用情况分别配制成不低于 2
4、.5%浓度的溶液,等量混合,取混合液进行核酸提取;液体胰酶,取至少 2 个最小包装的样品,等量混合,取混合液进行核酸提取。2.5.4 其他猪源衍生物 固体、液体或干粉状猪源衍生物,可分别按组织、血清或干粉状胰酶的方法进行取样和样品处理。3 核酸提取3.1 试剂和器材3.1.1 试剂 根据核酸提取方法确定,如氯仿、异丙醇、无水乙醇、0.1 mol/l 柠檬酸钠(含10%乙醇)、75%乙醇等。3.1.2 仪器 核酸含量测定仪;常温台式离心机;旋涡振荡器;水浴锅;微量移液器1套(最大量程分别为10 l、100 l、200 l、1000 l)。3.1.3 耗材 1.5 ml带盖离心管、无菌吸头(010
5、 l、0200 l、1001000 l)、一次性乳胶手套。3.2 操作程序(TRIZOL法),也可以选择其他等效核酸提取方法提取样品中的DNA。3.2.1 取样品 250 l,加入 750 l Trizol,颠倒混匀,室温放置5 分钟。3.2.2 加入200 l 氯仿,充分混匀,室温放置10 分钟,4下以12000 g 离心 15 分钟。3.2.3 弃去上清液,加入 220 l 无水乙醇,颠倒混合,1530放置 23 分钟,28以 2000 g 离心 5 分钟,沉淀物为 DNA。3.2.4 弃去上清液,加入含 10%乙醇的 0.1 mol/l 柠檬酸钠 750 l 洗涤 DNA,1530放置
6、30 分钟,28以 2000 g 离心 5 分钟。重复一次。3.2.5 加入 75%乙醇 1.2 ml,重悬 DNA 沉淀,1530放置 20分钟,42000 g 离心 5 分钟。可重复一次,充分洗涤 DNA 沉淀。3.2.6 弃去上清液,敞开离心管管口,在空气中干燥 510 分钟,加入 3050 l 的无核酸酶灭菌水溶解 DNA,20以下保存备用。3.3 注意事项3.3.1 核酸提取试剂具有腐蚀和强变性能力,应做好个人防护,佩戴手套、口罩和护目镜,防止液体飞溅到皮肤和眼睛。3.3.2 后续的核酸检测敏感性很高,要防止样品之间相互污染,最好使用带滤芯的枪头,且每次吸取取液体时均需更换枪头。3.
7、3.3 为防止核苷酸降解,应避免核酸酶污染,使用的耗材均需无核酸酶。3.3.4 做好剩余样品的无害化处理及操作台面的消毒处理。剩余样品可通过高压灭菌或煮沸处理,也可放在 1%卫可或 2%氢氧化钠消毒液中浸泡处理,操作台面使用 1%卫可擦拭。3.3.5 提取后的 DNA 样品要用锡箔纸封存,取样时应用枪头直接刺破锡箔纸取样,防止污染。4 检测下列两种方法可任选其一。4.1 实时荧光定量 PCR 检测法4.1.1 试剂和器材4.1.1.1 试剂4.1.1.1.1 荧光定量PCR试剂 本操作中以Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays kit为
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