酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交-ppt课件.ppt

酵母双杂交 是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。 酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与 反式转录激活因子 结构上是组组件式件式的， 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成， 其中有DNA结合结构域结合结构域(DNA binding domain， 简称为简称为BD)和转录激活结构转录激活结构域域(activation domain， 简称为简称为AD) 。 这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 酵母双杂交酵母双杂交系统的另一个重要的元件报道株指经改造的、含报道基因含报道基因(reporter gene)的重组质粒的重组质粒的宿主细胞。 最常用的是酵母细胞酵母细胞， 酵母细胞作为报道株具有许多优点优点: 1 易于转化、便于回收扩增质粒。2具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。3酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达酵母中表达两者的BD-Bait protein融合蛋白。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上,在酵母中表达两者的融合蛋白。如果诱饵蛋白诱饵蛋白和靶蛋白靶蛋白能够相互作用，那么GAL4 DNA 结合结构域和GAL4激活结构域就会相互作用，从而激活lacZ报道基因的表达。所以我们可以通过转化的酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白是否有相互作用。 这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生既不能产生GAL4，又不能合成，又不能合成ADE、 HIS 、LEU、TRP，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的酵母基因组中的报告基因报告基因ADE、 HIS、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。 综上：酵母双杂交系统通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为:1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒诱饵质粒。2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒文库质粒。3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 酵母双杂交系统的应用 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因与已知基因在生物学功能上的联系在生物学功能上的联系。 另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。2、利用酵母双杂交在细胞体内细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。 3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响 酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图 众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义 在酵母双杂交的基础上，又发展出了 酵酵母单杂交母单杂交、酵母三杂交酵母三杂交和酵母的反向杂交酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之核酸和文库蛋白之间间的研究、三种不同蛋白之间三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用两种蛋白相互作用的结构和位点。酵母单杂交技术最早是从酵母双杂交技术发展而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、蛋白之间的相互作用蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。原理原理用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因转录因子子。研究表明GAL4 的DNA结合结构域结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)；而转录激活结构转录激活结构域域可与RNA 聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA 聚合酶的活性。在这一过程中，DNA 结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。 据此，我们可将GAL4 的DNA结合结构域置换置换为其他蛋白，只要他能与我们想要了解的与我们想要了解的目的基因目的基因相互作用，相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。正是基于这一理论，酵母单杂交系统由2 部分组成： (1) 将与GAL4 转录激活域转录激活域 融合表达的cDNA 文库质粒文库质粒； (2)含有目的基因目的基因和下游报告基因的报告质粒报告质粒. 首先将报告质粒报告质粒整合入酵母基因组,产生带有目的基因的酵母报告株; 再将文库质粒文库质粒转化入报告株; 若存在文库蛋白与目的基因的相互作用,可通过对报告基因的表达将文库蛋白的基因筛选出来.酵母三杂交系统的原理酵母三杂交系统的原理与酵母双杂交相似，利用了酵母细胞的GAL4蛋白调节目的基因(半乳糖苷酶基因及His3基因)转录的特点。GAL4蛋白具有两个可分离的功能区，N端是DNA结合结构域，C端为转录激活结构域。只要这两个相对独立的结构域能够通过一定的方式在空间上足够的靠近(如借助其他分子的相互结合使其足够靠近)，即使它们之间没有共价结合也可激活转录，这为研究蛋白质与其他分子的相互作用提供了可能。上图显示了酵母三杂交系统的原理。在酵母三杂交系统，lexA启动子调控下游LacZ基因和His3基因的表达，而lexA启动子的激活取决于DNA结合结构域和转录激活结构域能否在空间上相互靠近。其中第一个融合蛋白第一个融合蛋白由两部分组成，一部分为能结合lexA启动子的DNA结合结构域，另一部分为噬菌体衣壳蛋白MS2。第二个融合蛋白第二个融合蛋白也由两部分组成，一部分为能激活lexA启动子的转录激活结构域，另一部分为有待研究的有待研究的RNA结合蛋白结合蛋白“Y”。这两个融合蛋白通过第三个融合第三个融合的RNA分子相连，其一端为含有噬菌体衣壳蛋白MS2结合位点的MS2RNA，另一端为有待研究的有待研究的RNA“X”。一旦“X”和“Y”能有相互作用就使得这个复合物形成一个功能性的转录激活因子，从而使得下游的LacZ基因和His3基因得以表达。LacZ基因的表达水平能够通过在体外检测半乳糖苷酶的活性来确定,His3基因的表达赋予了酵母细胞在缺乏组氨酸的培养基上生存的能力。通过缺陷培养基及半乳糖苷酶的活性的测定就能判断在酵母菌内是否发生了RNA“X”和蛋白质“Y”的相互作用。