PDMS基底弹性对大鼠骨髓间充质干细胞骨向诱导分化的影响_穆月.docx

中国医学科学院北京协和医学院硕士学位论文 学校代码 . 学 号 : 硕 士 学 位 论 文 (专业学位） PDMS 基底弹性对大鼠骨髓间充质干细胞 骨向诱导分化的影响 本研究受北京协和医院中青年科研基金资助 （ pumch-2013-010) 所院 ： 北 京 协 和 医 院 姓名 ： 穆月 指导教师： 赵继志教授 导师小组： 李倩副教授、杨春副教授 学科专业： 口腔医学 研宄方向： 口腔颌面外科学 完成日期： 2015 年 05月 10023 S2010001075 1 中国医学科学院北京协和医学院硕士学位论文 目录 mm . 1 ABSTRACT . 2 引言 . 3 PDMS 基底弹性对大鼠骨髓间充质干细胞骨向诱导分化的影响 . 5 . 5 1. I 实验动物 . . 5 1.2 各类试剂及试剂盒 . . 5 1.3 所用抗体 . 6 1.4 实验仪器 . 6 1.5 试剂配制 . 7 錢施 . 8 2.1 原代大鼠骨髓间充质干细胞的培养、传代及收集 . 8 2.2 PDMS 基底制备方法 . . 9 2.3 原子力显微镜 （ AFM)测量基底硬度 . . 9 2. 4 大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化标志蛋白的检测 . 10 2. 5 大鼠骨髓间充质干细胞成骨标记物 mRNA 水平表达 . . 12 2.6 免疫荧光染色检测成骨标记物的分布状态 : . 14 2.7 碱性磷酸酶活性测定 : . 14 统计分析方法 . 15 關 . 15 4. 1 大鼠骨髓间充质干细胞的培养 . . 15 4.2 基底材料硬度测量值 . . 16 4.3 免疫印迹检测 (Western blot)成骨标记物蛋白水平表达 . 16 4.4 实时定量聚合链式反应 (Real-time PCR)检测成骨标记物 mRNA 水平表达 . 17 4.5 免疫荧光染色检测成骨标记物的分布状态 . 18 4.6 碱性磷酸酶活性测定 . . 20 . 21 结论和展望 . 25 詩嫌 . 26 . 29 BMSCS 的骨向诱导分化及在口腔医学的应用 . 29 BMSC 的生物学特性 . 29 诱导分化的方法 . 29 骨髓间充质干细胞在口腔医学中的应用 . . 31 讨论与展望 . 32 参考文献 . 33 . 36 2 中国医学科学院北京协和医学院硕士学位论文 摘要 目的： 观察大鼠骨髓间充质千细胞 (Bone marrow-derived mesenchymal stem cells， BMSCs)在不同弹性的聚二甲基娃氧焼 (Polydimethylsiloxane, PDMS)基底上的骨 向分化差异，寻找合适的骨向分化基底硬度范围，明确高弹性模量的基底是否适合 BMSCs 向成骨细胞分化，以期未来能够通过调整骨替代材料的弹性，模拟适于骨向 分化的理想条件，从而提高其成骨诱导能力，最终在体内环境下达到骨组织重建的 最佳状态。 方法： 本研宄拟结合材料学、生物力学和分子生物学的理论和方法，进行体外实验。 以 PDMS 制备弹性模量为 2170±340 KPa、 354±40 KPa、 50±12 KPa、 14± lKPa、 4土 O.lKPa 的基底，模拟生物体内不同组织的弹性，培养大鼠骨髓间充质干细胞，利用 实时定量聚合链式反应 (Real-time PCR)、 免疫印迹检测 (Western blot)、 免疫荧 光染色检测（ Immunofluorescence)、 碱性磷酸酶活性测定 （ Alkaline Phosphatase Assay)等方法，从细胞形态、成骨分化分子指标蛋白检测和细胞功能等方面来评 估调控 PDMS 的基质弹性对骨髓间充质千细胞骨向分化影响。 结果： PDMS能够模拟生物体内不同组织的弹性，弹性模量可从 2170±340 KPa到 4士 O.lKPa,经过表面修饰后，大鼠 BMSCs 在其上贴壁良好，形态规则，培养 7后， 不同弹性基底上的 BMSCs 表现出骨向分化差异。 在弹性模量为 2170±340 KPa、 354±40 KPa、 50±12 KPa、 14± lKPa、 4±0. lKPa 的PDMS 基底上诱导培养 7天后，大鼠 BMSCs 在弹性模量为 354±40 KPa 的基底上表 现出更显著的骨向分化能力，与本组实验内其他弹性模量的基底比较有显著性差异 结论： PDMS 可满足弹性基底诱导大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化实验的要求，可作为 良好的观察其体外培养的实验基底材料。 PDMS 基底的弹性模量在 354±40 KPa 范围内时 ,BMSC 向成骨系方向分化最理想。 关键词：骨髓间充质干细胞，聚二甲基硅氧烷，基底弹性诱导，骨向分化 1 中国医学科学院北京协和医学院硕士学位论文 ABSTRACT BACKGROUND Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) are multipotent adult stem cells with the potential to differentiate into a variety of cell types， including neural cells， vascular smooth muscle cells, osteoblasts, chondrocytes and adipocytes. Therefore, BMSCs are an important cell source for tissue repair and regeneration. Currently, study shows that physical characteristics of biomaterial and microenvironment around cells could direct the differentiation of BMSCs, especially matrix elasticity. Based on these findings, we suppose that alter the elasticity of bone substitute materials, could induce the BMSCs to differentiate to osteoblast, and enhance the therapy effects of bone grafts ultimately. OBJECTIVE In this study, we aim to observe the role of different matrix elasticity in the differentiation of BMSCs on Polydimethylsiloxane(PDMS), and to make sure whether the stiff matrix is more suitable to induce BMSCs to osteogenic differentiation than soft matrix, and find the ideal range of elasticity. METHODS AND RESULTS To investigate the role of different matrix elasticity in the differentiation of BMSCs, we utilize tunable elasticity PDMS which can be manipulated by adjusting the relative concentrations of cross-linking agent: 1:10, 1:20, 1:35, 1:60, 1:80. The Young's modulus was used to describe the elasticity of PDMS after measured by Atomic Force Microscope (AFM), that are 2170±340KPas 354±40KPas 50±12KPa. 14±lKPa. 4±0.1KPa. After surface modification, BMSCs was seeded on PDMS matrix, and 7 days after BMSCs cultured on the five different Young's moduli matrix, we observed the differences of osteogenic differentiation of BMSCs by the method of Real-time PCR, Western blot, Immunofluorescence and Alkaline Phosphatase Assay. The osteogenic differentiation markers were Type I collagen, alphal (Col-I)5 osteocalcin(OCN), osteopontin(OPN) and bone morphogenetic protein 2(BMP2). The results show that PDMS is suitable for cell culture after surface modification, and by the means of altering the concentration of cross-linking agent, PDMS could mimic the majority of the tissues' elasticity in human body. The cells cultured on PDMS were extended well, and related osteogenic differentiation markers shows differences between five matrixes. Among the five different elasticity, there is a significant difference of osteogenic marker expression on the group of 1:20, which the Young's modulus is 354±40 KPa(P 1:10 1:20 1:35 1:60 1:80 >-丨 .上 . 叙一 :二趨 ! 4. 3基底材料硬度测量值 AFM 的力学测定用于研究材料的机械性能，利用 AFM 力距离曲线测量系统在相 同的负载速率下测量得到材料表面力的曲线，每个硬度的材料分别测量至少 10 个 点，获得至少10条力曲线。测量值如表 7,可知基底弹性硬度随交联剂的减少而下 降，呈现数量级的差异。 表 7 PDMS 硬度测量结果 HDMS配比 均值 （ MPa) 标准差 1:10 2. 17 0.34 1:20 0. 354 0. 04 1:35 0.05 0.012 1:60 0. 014 0.001 1:80 0.004 0. 0001 4.4免疫印迹检测 (Western blot)成骨标记物蛋白水平表达 将大鼠骨髓间充质干细胞分别培养于 5 个不同硬度的胞外基质上，提取接种 7 天后细胞的总蛋白，用 Col-I、 OPN、 BMP2 的特异性抗体进行免疫印记实验 ， GAPDH 作为内参。成骨分化标志蛋白的表达在 PDMS 交联剂比例为 1: 20 的基底上有明显 增高的趋势。结果如图 3。 16 中国医学科学院北京 I 办和医学院硕上学位论义 L 1:10 1:20 1 35 1:60 1 80 cross-linker ratios .10 1:20 1:35 1:60 1:80 cross-li 门 ker ratios A:不同弹性模量基底上各成骨分化标志蛋白的表达差异； B、 C、 D:不同成骨分 化标志蛋白在不同弹性模量基底上表达差异的统 计。该实验结果来自 8 次独立实验， 各 组 值 与1:10 组 进 行 比 较 ， 表 示 P aluolojdI t-L XLn sla)Aa>lutallojd17 中国 E 学科学院北京协和 E 学院硕上学位论文 * * i T r1! 1:10 1:20 1:35 1:60 1:80 cross-linker ratios BMP2 1:10 1:20 1:35 1:60 1:80 cross-linker ratios 1:10 1:20 1:35 1:60 1： 80 cross-linker ratios OCN 1:10 1:20 1:35 1:60 1:80 cross-linker ratios A、 B、 C、 D : BMSCs 在不同弹性模量基底上的成骨分化标志基因的表达差异。 对实时荧光定量 PCR 所得 CT 值进行统计，该实验结果来自四次独立实验，各组值 与 1 : 1 0组 进 行 比 较 ， 表 示 P ,1.5- C 0) 1.0- c E 0.5- 0.0 JL 2.5-, OPN 2.0- > 1 1.5- T 1n 10- E 0.5- 1nn1:10 1:201:35 1:60 1:80 cross-linker ratios 1:10 1:20 1:35 1:60 1:80 cross-linker ratios A、 B、 C、 D: Col-1、 0CN、 OPN 成骨分化标志蛋白在不同弹性模量 PDMS上的免 疫荧光强度。 A、 B、 C:激光共聚焦显微镜下的细胞染色结果，标尺 25 ym,统计结 果如 D 图。各组值与 1 : 1 0 组 进 行 比 较 。表示 P Winer JP, Janmey PA, McCormick ME, et al. Bone marrow-derived human mesenchymal stem cells become quiescent on soft substrates but remain responsive to chemical or mechanical stimuli J. Tissue Eng Part A, 2009.15(1): 147-54. 19 .王秋实，杨孝勤，朱晓文，等 .动静态不同牵张条件下大鼠骨髓间充质干细胞的增殖与分化 J.中国组织工程研究， 2 13, 17(36):6396-64 2. 33 中国医学科学院北京协和医学院硕士学位论文 20 Jang JY, Lee SW, Park SH, et al. Combined effects of surface morphology and mechanical straining magnitudes on the differentiation of mesenchymal stem cells without using biochemical reagents J. J Biomed Biotechnol, 2011. 2011: 860652. 21 . Shi D, Meng R, Deng W, et al. Effects of microgravity modeled by large gradient high magnetic field on the osteogenic initiation of human mesenchymal stem cells J. Stem Cell Rev, 2010. 6(4): 567-78. 22 . Wood JA, Ly I, Boijesson DL, et al. The modulation of canine mesenchymal stem cells by nano-topographic cues J. Exp Cell Res, 2012. 318(19): 2438-45. 23 . Song IH, Al Caplan, JE Dennis, et al. In vitro dexamethasone pretreatment enhances bone formation of human mesenchymal stem cells in vivo J. J Orthop Res, 2009.27(7): 916-21. 24 .Jabbarzadeh E, Blanchette J, Shazly T, et al. Vascularization of Biomaterials for Bone Tissue Engineering: Current Approaches and Major Challenges J. Current Angiogenesis, 2012. 1(3): 180-191. 25 .Hibi H, Yamada Y, Ueda M, et al. Alveolar cleft osteoplasty using tissue-engineered osteogenic material J, Int J Oral Maxillofac Surg, 2006, 35(6): 551-5. 26 .Meijer GJ, de Bruijn JD, Koole R, et al. Cell-based bone tissue engineering. PLoS Med, 2007. 4(2): e9. 27 . Lee J, Sung HM, Jang JD, et al. Successful reconstruction of 15-cm segmental defects by bone marrow stem cells and resected autogenous bone graft in central hemangioma J. J Oral Maxillofac Surg, 2010. 68(1): 188*94. 28 .Shayesteh YS, Khojasteh A, Soleimani M, et al. Sinus augmentation using human mesenchymal stem cells loaded into a beta-tricalcium phosphate/hydroxyapatite scaffold J. 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J Craniofac Surg, 2013. 24(4): 1292-7. 34 中国医学科学院北京协和医学院硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研 宄成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 学位论文作者签名 : 签 字 曰 期 ： 年 5 月 J 曰 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 北京协和医学院 有关保存、使用学位论文的管理 办法。有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权 北京协和医学院 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书 ） 学位论文作者签名 : 导师签名 : 签 字 曰 期 ： 年 月 ; 曰 签字曰期： >_年 <月 J曰 学位论文作者毕业后去向 : 工作单位： 电话 : 邮编 : 通讯地址 : 35 中国医学科学院北京协和医学院硕士学位论文 致谢 每当我回想起这三年的研宄生学习生活，总是有一个词语浮上心头：感恩。从 三年前有机会进入协和医学院学习，到在协和医院口腔科进行临床学习，再到能够 在清华大学生物力学所进行基础生物科学的学习，我认为自己是最幸运的。 感恩我的导师赵继志教授，他严谨的治学态度、渊博的知识和对病患的耐心和 细致，成为我不断学习和进取的榜样。在临床学习中，赵老师言传身教，临床治疗 中的点点滴滴让我深切了解了作为一名临床医生，扎实的基本功和不断治学的态度 是多么重要；在科学研究的学习中，赵老师的指导和点拨总能让我在新的方向上得 到提高和完善，让我对科学研宄的认识逐步清晰，为我打开了科研这扇大门；作为 科室的主任，赵老师以其正直、沉稳的个人魅力领导全科人员一步步扎实前进，在 这样积极、友善的氛围中，作为学生受益良多。在此衷心祝愿赵老师身体健康、工 作顺利！ 感恩我的副导师李倩教授，李老师在本实验及论文写作中倾注了巨大心血，在 实验进行过程中，李老师在百忙之中抽出时间与我细致沟通，指导并尽最大努力帮 我解决实验中出现的问题，使得实验能够顺利进行。作为我的科研指导教师，李老 师不断启发我的思维，拓展我的眼界，鼓励我多学习，多思考，其丰富 的实验经验 和敏锐的科研洞察力是我不断学习的榜样。衷心感谢李老师在我学习和生活中的关 怀和帮助！ 感恩本实验的合作实验室清华大学生物力学所的全体老师和同学，实验室杨春 教授在本实验研究中给予了大力的支持和帮助，她缜密的逻辑思维和严谨的科研态 度是我未来学习的榜样。实验室祖岩、孙正龙、李靖、周帅、徐越等师兄师姐在学 习和生活上给予了我悉心的指导和帮助，让我融入这个大家庭，与他们共同进步， 使我倍感温暖。 感恩医院的全体老师和同学们，在我的临床学习中，各位老师认真负责，循序 善诱，让我在临床技能和医患沟通能力等 方面有了非常大的提高；在丰富的研宄生 生活中，各位同学互相关怀，彼此支持，一起走过了美好的三年时光。 感恩我的家人和朋友，他们的默默支持和鼓励是我前进的不竭动力。 最后，衷心感谢在百忙之中评阅论文和参加答辩的每位专家、教授！ 穆月 二一五年五月 36