2022年动物寄生虫病PCR诊断技术.docx

精品学习资源动物寄生虫病 PCR诊断技术聚合酶链反应 Polymerase Chain Reaction, PCR技术是一种既敏锐又特异的DNA 体外扩增方法， 它可将一小段目的DNA扩增上百万倍，其扩增效率使得该方法可检测到单个虫体或仅部分虫体的微量DNA ；通过设计种、 株特异的引物， 此法只扩增出种、 株特异的 PCR 产物， 具有很高的特异性；而且 PCR技术的操作过程也相对简便快捷，无需对病原进行别离纯化；同时可以克服抗原和抗体连续存在的干扰， 直接检测到病原体的DNA ，既可用于虫种、株的鉴别，动物寄生虫病的临床诊断，又可用于动物寄生虫病的分子流行病学调查；随着PCR技术的不断完善与进展，它已广泛应用于分子生物学、生物技术、临床医学等各个领域，具有广泛的应用前景；一、试验目的要求把握 PCR诊断技术所涉及试验的基本原理，全面熟识PCR诊断技术的操作过程，其中包括寄生虫DNA 的提取、 PCR引物的设计、 PCR条件的优化、对目的片断的扩增、琼脂糖凝胶电泳及结果分析、PCR产物的纯化等等；二、试验仪器和材料一寄生虫基因组DNA的提取及纯化1. 虫体材料； 单个虫体；2. 器具； 超净工作台、 恒温培育箱、 TGL-16G高速台式离心机、 旋涡振荡器、 微量取液器及配套吸头、微量离心管、一次性注射器、微型眼科镊、微型眼科剪刀、玻璃平皿、滴管、有机架等；(1) 乙二胺四乙酸 Ethylene diaminetetra acetic acid ，EDTA 、十二烷基磺酸钠 Sodium dodecyl sulfate ，欢迎下载精品学习资源SDS、三羟甲基氨基甲烷-盐酸 Tri Hydroxymethyl Aminomethane-HC，l K 25g/ l、异丙醇 80%、双蒸水、灭菌超纯水等；Tris-HCl 、氯化钠、蛋白酶欢迎下载精品学习资源(2) DNA 裂解液： 500 mM NaCl 70 10%SDS 30 l ；l、100 mM Tris-HCl pH 30 l、50 mM EDTA pH 150l 、欢迎下载精品学习资源(3) Wizard TM DNA Clean-Up试剂盒或类似的 DNA 提取试剂盒；二 PCR 扩增及琼脂糖电泳1. 材料； 提纯的虫体 DNA ；2. 器具； 超净工作台、微型高速台式离心机、微量取液器2/20/200/1000 l 、PCR 扩增仪、琼脂糖电泳系统、凝胶成像系统、微波炉、4 /-20冰箱、紫外透射仪、微型离心管200/500/1500l、有机架、一次性手套、透亮胶带、量筒100 ml 、三角瓶 500 ml 等；3. 试剂；1 10 × PCR Buffer 无 Mg 2+、dNTP 2.5 mM each 、ddH 2O 、MgCl 225 mM 、Primers、Ex Taq酶5 U/l 、琼脂糖、 EB10mg/ml 、Tris 碱、硼酸Boric acid 、去离子水、 EDTA 0.5 mol/L ，pH 8.0 、10×载样缓冲液；× TBE 缓冲液：精确秤取Trisgg，充分溶解于800 ml 去离子水中，加 10ml 0.5 mol/L EDTA pH8.0 ，用去离子水定容至1000ml ；三 PCR 扩增产物的纯化1. 材料； PCR 扩增产物；2. 器具； TGL-16G 高速台式离心机；三用电热恒温水箱；微量取液器2/20/200/1000 l 、琼脂糖电泳系统、微波炉、电子天平、4 /-20冰箱、紫外透射仪、微型离心管500/1500l 、有机架、透亮欢迎下载精品学习资源胶带、一次性注射器、量筒100ml 、三角瓶 500ml 、手术刀、保鲜纸等；× TBE 缓冲液；UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒； UNIQ-10 柱式 PCR 产物纯化试剂盒； 异丙醇 80%等；三、试验方法、步骤和操作要领 一寄生虫基因组 DNA的提取及纯化1. 试验原理；应依据讨论目的来打算是从单个虫体仍是多个虫体提取基因组DNA；寄生虫虫体的各个部位都可以作为基因组DNA的抽提材料，假如虫体较大的话可取其中部而储存其头部及尾部，以备外形学鉴定以验证其种类；假如虫体较小小于1 cm ，就应使用整条虫体抽取DNA；假设虫体特殊细小例如 幼虫，可用多条虫体来提取DNA；为了获得高含量、 高纯度的 DNA，最好使用新奇材料； 从冻干或 50%-70%乙醇储存的寄生虫材料中也可较简单地提取DNA；寄生虫 DNA的抽提方法有多种，不同种类的寄生虫虫体都有其最适合的抽提方法，但各种方法的基本原理都一样，即先用机械的方法将虫体组织破裂，然后加入DNA裂解液和蛋白酶 K，充分作用后，虫体组织中的细胞膜破裂，蛋白质变性，将虫体基因组DNA释放到溶液中；在裂解过程中，虫体细胞碎片及大部 分蛋白质会相互缠绕成大型复合物，后者被DNA裂解液中的 SDS包盖，通过离心沉淀，这些复合物会从溶液中沉淀下来，变性剂也同时被除去，从而就可从上清中回收虫体基因组DNA溶液；回收后的虫体基因组DNA 液用 Wizard TM DNA 纯化试剂盒进行纯化；纯化时，DNA溶液与纯化试剂盒中的清洗树脂混合后，其 混合液在通过微型柱时DNA会结合在柱上，而其它杂质会通过微型柱排出；再用80%异丙醇进行冲洗，去除残余杂质；最终，在微型柱中加入预热的TE 缓冲液或超纯水，使结合在微型柱上的DNA充分溶解，通过离心，其洗脱液即为纯化的虫体基因组DNA溶液；2. 试验方法、步骤和操作要领；(1) 虫体材料的处理 假设为新奇或冻干储存的虫体，就不需要此步骤 ；ml 的离心管中；假设虫体较小，取一整条虫体经如上洗涤处理；对于鸡球虫，将储存在2.5%重铬酸钾溶液的卵囊悬液以2000× g 离心 10min ，弃重铬酸钾溶液；以双蒸水重悬，同法离心洗涤三次后，用20% 次氯酸钠处理卵囊20min ， 2000× g 离心沉淀卵囊，用适量饱和盐水重悬卵囊沉淀， 1500× g 离心 10min ，上清液加入4 倍体积的灭菌双蒸水， 3000× g 离心 10min ；卵囊沉淀再用上述方法重新漂浮、洗涤一次；用少量灭菌双蒸水重悬卵囊沉淀，然后将其轻轻地加在0.6M 无菌蔗糖溶液之上， 2000× g 离心 5min ，取上层卵囊加5 倍体积的水， 3000 ×g 离心 10min ，沉淀再用无菌蔗糖溶液漂浮一次，即可得纯洁的卵囊，可立刻用于裂解以提取DNA；(2) 虫体材料的裂解；用灭菌且经紫外灯照耀过的微型眼科剪刀将虫体组织剪碎， 加入 280l 的 SDS 裂解缓冲液， 轻轻混匀， 再加入 20l25g/ l 的蛋白酶 K 溶液； 对于原虫如鸡球虫、 隐孢子虫， 将纯化好的卵囊 3000rpm/min 离心 10min ，去掉大部分上清后加入与卵囊体积相同的玻璃珠，漩涡震荡直到有 95卵囊破壁后，即可加入SDS 裂解缓冲液及蛋白酶 K 溶液；混匀后， 放于恒温培育箱中， 37作用 1248 h ，其间不时摇动离心管， 使虫体组织裂解充分；(3) 虫体 DNA 的抽提和纯化；第一进行虫体 DNA 提取，然后按 Promega公司试剂盒 Wizard TM DNA Clean-Up System 使用说明对 DNA进行纯化；方法如下： 取出于恒温培育箱中作用了约 20 小时的离心管，旋涡震荡器震荡混匀， 10000rpm 离心 2min ，上清即为虫体 DNA 溶液；将上清转移至一新的离心管中，加入 1ml 清洗树脂按 50 500l 悬液/1 ml 清洗树脂的比例，旋涡震荡混匀；欢迎下载精品学习资源 取一支 5ml 的一次性注射器，去针头，拔出注射器内芯推液筒，接上Wizard TM 微型柱； 将 DNA- 树脂混合液全部转移到注射器中，用注射器内芯推液筒，渐渐地将DNA- 树脂混合液推过微型柱，排出废液； 将注射器从微型柱上拔出后，拿去注射器内芯推液筒，再将注射器套在微型柱上，向注射器内加入 2 ml 柱洗溶液 80%的异丙醇，用注射器内芯推液筒渐渐将洗柱液通过微型柱，以洗涤DNA- 树脂样品； 拔去注射器，将微型柱套在洁净的1.5ml 离心管上， 10000rpm 离心 20sec，以除去残留的异丙醇； 将微型柱从注射器上转移到一新的离心管上，在柱中心加入30 50l 预热 6070的超纯水或 1× TE 缓冲液，静置 1 min， 10000rpm 离心 20sec；离心管内的液体即为DNA 溶液；可将 DNA 溶液转移至 0.5 ml 离心管中于 -20冰箱储存备用；二寄生虫 DNA的 PCR扩增及琼脂糖电泳1. 试验原理；(1) PCR 引物设计； PCR 反应胜利扩增的一个关键条件在于寡核甘酸引物的正确设计；PCR引物设计的目的是找到一对合适的寡核甘酸片段，使其能有效地与目的片段两端的序列互补；设计引物时要遵循以下原就： 长度不能太长，也不能太短，一般在18 25 个碱基左右； G+C 含量及 Tm 值：引物的 G+C 含量以 40% 60%为宜；引物的 Tm 值是指寡核苷酸的解链温度， 即在肯定盐浓度条件下50%寡核苷酸双链的解链温度；PCR 引物应保持合理的G+C 含量；含有 50%G+C 的 20 个碱基的引物其 Tm 值约界于 56 62，这可为有效退火供应足够的温度；由于G+C 间的氢键数较A+T间多，因此， G+C 含量高的DNA片段其Tm 值也高；对于短于20 个碱基的引物， Tm 值可按Tm=4G+C+2A+T运算；而对于较长的引物，Tm 值的运算较为复杂；由于 PCR 扩增的特异性取决于两条引物与相应模板的结合，因此，反应中退火温度应依据两个Tm 值折衷挑选； 碱基的组成尽量随机，尽量不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在；特殊是3末端不应超过 3 个连续的 G或 C； 引物内部不应有互补序列，否就引物自身会折叠形成发夹结构或引物本身复性；这样二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合；假设引物自身连续互补碱基达3 个以上， 就简单形成发夹结构； 两个引物之间不能互补，特殊应防止3末端的互补重叠以防止形成引物二聚体；两个引物不应有4 个以上的碱基连续相同或互补； 引物的 3末端应与目的片段完全相配；这对于获得好的扩增结果特别重要；假如能确定一个保守氨基酸，可将其密码子的前2 个碱基作为 3末端； 引物的 5末端可不与目的片段互补，可被修饰而不影响扩增的特异性；引物的 5末端修饰包括： 加酶切位点，标记生物素、荧光、同位素、地高辛等；仍可引入蛋白质结合DNA序列、引入突变位点、引入翻译起始密码子、启动子序列等；所附加的限制性酶切位点应是不会在引物以外的DNA上切割的；为了有效地切割限制性酶切位点，在限制性酶识别序列的5端常需添加2-3 个非特异的额外碱基；2+ 假设是设计种或株特异性引物，引物与非特异序列的相像性不能超过70%或有连续 8 个以上的互补碱基相同；可用 DNAstar 、MegAlign 软件比较相像性，用Oligo50来设计引物；(2) PCR 的基本原理；在存在 DNA模板、引物、 dNTP、适当缓冲液 Mg 的反应混合物中，在热稳固 DNA聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片段进行扩增；这种扩增是通过模板DNA、引物之间的变性，退火复性 ，延长三步反应为一周期cycle ，循环进行，使目的DNA 片段得以扩增；由于每一周期所产生的DNA片段均能成为下一次循环的模板，故PCR产物以指数方式增加，经30 个周期欢迎下载精品学习资源9后，特定 DNA片段的数量在理论上可增加10 倍；在实际应用中，一般多用30 35 个循环；(3) 琼脂糖电泳的基本原理；琼脂糖是一种自然聚合长链状分子，于沸水中溶解，45开头形成多孔性滤孔，凝胶孔径的大小打算于琼脂糖的浓度；DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场的作用下向正极泳动； DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应；不同的DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带；琼脂糖凝胶电泳法别离DNA，主要是利用分子筛效应， 迁移速度与分子量的对数值成反比关系；溴化乙锭 EB为扁平状分子， 在紫外光照耀下发射荧光；EB可与 DNA分子形成 EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB 发射的荧光强度大10 倍以上，且荧光强度与 DNA含量成正比；2. 试验方法、步骤和操作要领；(1) PCR 扩增； 先按单倍扩增体系中各试剂的量运算好n 倍除去模板DNA 量扩增体系中各试剂相对应的量，然后在适合体积的离心管中依次加入试剂如n× 2.5 l10× PCR Buffer 、n× 2 ldNTP ， n× 4 lMgCl 2、n× 0.5 lForward primer 、n× 0.5 lReverse primer 、n× 14.4 lddH 2O、n× 0.125 lEx Taq酶，最终总体积为n× 24 l，经离心混匀后，分装至n 个 200l的离心管中包括阴阳性对比，在各管中加入模板 DNA 如扩增体系为 25 ，l就加入 1 l模板 DNA ，混匀后于 PCR 扩增仪中按已设好的PCR扩增条件进行扩增；如细胞色素 c 氧化酶第一亚基 cytochrome c oxidase subunit 1, cox1基因的扩增体系为：试剂ddH 2O体积 l10x PCR BufferMgCl 2 25 mMdNTPs 2.5 mM each2Forward primer 100 pmol/l, JB3Reverse primer 100 pmol/Ex Taq 5 U/ll, JB4.5模板 gDNA1总量25coxI 基因的 PCR 扩增条件：94变性5 min94变性30 s55复性30 s30 个循环72延长30 s72延长5 min扩增完毕后，取出PCR 扩增产物于 4 /-20冰箱储存备用；(2) 琼脂糖凝胶电泳； 制备凝胶：胶浓度视详细情形而定；以配制0.8%琼脂糖凝胶为例，精确称取0.8 g 琼脂糖加入至100 × TBE 电泳缓冲液， 于微波炉中或经高压熔化匀称，冷却至 50左右， 加入溴化乙锭 EB 10 mg/ml,加入量为 8.3 lEB/100 ml 琼脂糖凝胶液 ，混匀后倒入已封好的凝胶灌制胶模中，插上样品梳；待胶凝固后，从胶模上除去封带，拔出梳子放入电泳槽中，加入足够量的电泳缓冲液要求缓冲液液面高出凝胶外表约 1 mm ；欢迎下载精品学习资源 点样：取 PCR 扩增产物 3 5 ，l与适量的加样缓冲液Loading buffer, LB 混匀 假设为 6XLB ，3-5 l扩增产物加 1 l6X LB ，然后用取液器将样品加入点样孔中，同时设以相宜的DNA 分子量标准物marker作为参照； 电泳：接通电极，使 DNA 向阳极移动，在 1 10 V/cm 凝胶的电压下常用100 V进行电泳；当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够别离DNA 片段的距离时，关闭电源； 结果观看：将电泳好的琼脂糖胶置于紫外透射仪中，打开紫外灯，假设看到橙红色的核酸条带，就说明有扩增的PCR 产物；依据条带粗细，可粗略估量该条带的DNA 量；依据已知分子量的标准DNA对比，通过线性DNA 条带的相对位置可初步估量扩增产物的分子量；假如仅显现预期分子量大小的条带而无非特异性条带，就说明扩增的特异性较好；假如扩增结果比较中意，就用凝胶成像系统进行摄影，保 存图像；三 PCR扩增产物的纯化1. 试验原理； 为验证 PCR 扩增产物的种或株特异性， 往往需对 PCR 扩增产物进行测序验证； 为了建立种、株特异的 PCR 诊断技术，需要确定种、株特异的遗传标记；在这样的情形下，往往需要将 PCR 产物进行纯化， 连接到克隆载体， 转化宿主菌， 然后经菌落 PCR 及限制性内切酶酶切鉴定挑选阳性菌落进行测序；获得纯度高的PCR 产物是进行连接、转化、测序的前提条件；PCR 产物的纯化方法一般有两种： 一种是切胶回收， 另一种是 PCR 产物直接回收； 切胶回收的原理就是通过琼脂糖凝胶电泳，将要回收的目的片段从凝胶上切下来， 然后再通过 DNA 胶回收试剂盒进行纯化， 以去除 DNA 样品中除了目的基因片段外的全部杂质；而PCR 产物直接回收法就是将扩增的PCR 产物直接用PCR 产物纯化试剂盒进行纯化；两种方法各有利弊，切胶纯化的纯度较高，但回收率低；PCR 产物直接纯化，回收率高，但纯度较低；假如 PCR 扩增产物很特异，且引物长度小于60 bp ，就两种方法都可选用，但假如有非特异性条带或引物长度大于 60 bp 时，就必需用切胶纯化的方法；2. 试验方法、步骤和操作要领；(1) 切胶纯化法 按生工生物工程 上海 UNIQ-5 柱式 DNA胶回收试剂盒说明进行 ： 取 4050 1 PCR 产物于 0.8的琼脂糖凝胶中电泳约4050 min可适当缩短电泳时间以提高回收效率；留意： 必需将电泳槽用自来水充分冲洗，电泳缓冲液肯定要换新奇洁净的，以保证不会有其它DNA 污染； 于紫外透射仪中铺上一块新奇的保鲜纸，将凝胶放在保鲜纸上以尽量提高 DNA 回收的纯度， 打开长波紫外灯用洁净的手术刀快速将目的片段从琼脂糖凝胶上切下来尽可能去除余外的琼脂糖胶；切下来的胶块放入一新奇、灭菌的 1.5 ml 的离心管中，用电子天平称重并作好记录； 按每 100 mg 琼脂糖凝胶或 100 l 的 DNA 溶液加入 400 l Binding buffer 的量来运算， 加入相应体积的 Binding buffer ，混匀后置于 5060水浴中 10 分钟，使胶完全融解加热融胶时，每 2 分钟混匀一次； 将融解的胶溶液转移到套放于 2 ml 收集管的 UNIQ-10 柱中，室温放置 2 min ，用台式离心机高速8000 rpm 离心 1 min ；适当降低离心转速有助于提高DNA 结合率； 取下 UNIQ-10 柱，倒掉收集管中的废液， 将 UNIQ-10 柱放回收集管中， 加入 500 l Wash solution ，高速离心 10000 rpm 30 sec； 重复步骤“”一次； 取下 UNIQ-10 柱，倒掉收集管中的废液，将 UNIQ-10 柱放回收集管中，高速离心 10000 rpm1 min ； 将 UNIQ-10柱放入一新奇洁净的1.5 ml 离心管中， 在柱膜中心加30 l Elution Buffer或双蒸水pH欢迎下载精品学习资源 7.0到 UNIQ-10柱中，室温或 37放置 2 min ；提高洗脱温度至55-80有利于提高 DNA 的洗脱效率 10000 rpm 高速离心 1 min ，离心管中的液体即为回收的DNA 片段，可立刻使用或储存于-20备用； 取 35 l PCR 纯化产物加适量加样缓冲液混合，琼脂糖电泳检查回收率， 可依据带的亮度估算DNA回收纯化后的浓度；(2) PCR 产物直接纯化法按生工生物工程 上海 UNIQ-5 柱式 PCR产物纯化试剂盒说明进行 ： 取 PCR 产物 4050 l，加入 3 倍体积的 Binding buffer ，混匀； 把混合液转移到套放于 2 ml 收集管的 UNIQ-10 柱中，室温放置 2 min ，用台式离心机高速 8000 rpm 离心 1 min ；适当降低离心转速有助于提高 DNA 结合率； 倒掉收集管中的废液， 将 UNIQ-10 柱放入同一收集管中， 加入 500 l Wash solution ，高速离心10000rpm 30 sec； 重复“”步骤一次； 倒掉收集管中的废液，将 UNIQ-10 柱放回收集管中，高速离心 10000 rpm 1 min ； 将 UNIQ-10 柱放入一根新奇洁净的 1.5 ml 离心管中，在柱膜中心加入 30 l Elution Buffer 或双蒸水 pH 7.0到 UNIQ-10 柱中，室温或 37放置 2 min 提高洗脱温度至 55-80有利于提高 DNA 的洗脱效率； 10000 rpm 高速离心 1 min ，离心管中的液体即为回收的 DNA 片段，可立刻使用或储存于 -20备用； 取 510 l PCR 纯化产物加适量加样缓冲液混合，电泳检查回收率，可依据带的亮度估算DNA 回收纯化后的浓度；六动物寄生虫病特异PCR诊断技术实例以检测鸡柔嫩艾美尔球虫感染为例，选用Fernandez 等 2003 报道的柔嫩艾美尔球虫种特异的引物Tn-01-F ：5-CCGCCCAAACCAGGTGTCACG-3; Tn-01-R ：5-CCGCCCAAACA TGCAAGA TGGC-3 ，建立特异、敏锐、快速的特异PCR 诊断技术，用于鸡柔嫩艾美尔球虫感染的诊断及分子流行病学调查；1. PCR 反应；按常规方法进行，在0.2ml PCR 管配制反应液，总体积为25L，其中：试剂10x PCR Buffer体积 lMgCl 225 mM dNTPs 2.5 mM each 2Forward primer Tn-01-F, 50 pmol/ Reverse primer Tn-01-R, 50 pmol/ddH 2Ol lr Taq 5 U/ l 模板 gDNA 1同时设阳性对比和空白对比；2. 反应在 PCR 仪上进行； 反应条件为： 96预变性 5 min ，然后 94变性 1min 、65退火 2min ， 共 30 个循环，最终72后延长 7 min；3. 结果判定； PCR 产物在 1.0%TBE 琼脂糖凝胶电泳， 用溴化乙锭染色， 紫外投射仪下观看结果；阳性对比可见分子量大小约530bp 的条带；临床样品如有同样大小条带判为阳性；阴性对比不见扩增条带；欢迎下载精品学习资源四、试验留意事项一寄生虫基因组DNA的提取及纯化 1操作中所使用的镊子和剪刀肯定要事先灭菌并于超净工作台中紫外照耀11.5 h，以保证没有污染其它 DNA ；2. 吸取上清液时，应留意勿将下层沉淀物吸入以免带入杂质，但也不要余下太多上清液，致使DNA缺失较多；3. 整个操作过程中， 肯定要留意不要交叉污染；犹如时进行多个虫体DNA 的提取时肯定要作好标记；操作完毕后，台面要用酒精擦拭数次；镊子和剪刀经清洗后先用酒精消毒，再用紫外灯照耀12 小时以破坏或降解残余的 DNA ，以免污染其它试验；二寄生虫 DNA的 PCR扩增及琼脂糖电泳1. 在 PCR 扩增操作过程中，肯定要留意每加完一种试剂后，要换一次枪头，以免试剂被污染，且加试剂时肯定要留意不要加错、重加或漏加，最终加模板DNA 时要用记号笔在管上作好标记，以免结果混淆；2. 用微波炉煮胶时，胶液的量不要超过三角瓶容量的1/3，否就易溢出；3. 煮好的胶应冷却至50左右时再倒入胶模中，以免胶模变形，并削减漏胶的时机；4. 倒胶留意厚度 46 mm，充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔外形完好；也可待胶稍凝固后，放入 4冰箱 10 多分钟，以加速胶的凝固；5. 加样前需赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐；6. 凝胶中含有EB有潜在的致癌性 ，不要直接用手接触凝胶，操作时要戴上手套；废弃胶应集中处理，切勿乱丢；三 PCR扩增产物的纯化1. 试剂盒首次使用前，必需按说明书在Wash solution 瓶中加入 4 倍体积的无水乙醇，充分混匀后使用；每次使用后肯定要将瓶盖拧紧，以保持Wash solution 中的乙醇含量；2. 切胶回收时，于紫外透射仪中切胶的时间应尽可能短，以削减凝胶在紫外光照耀下的时间；3. 切胶回收时，对于高浓度的胶1.52% ，每 100 mg 凝胶加入 700 l Bindingbuffer ，融胶时间可以延长到 15 分钟，以保证凝胶全部融解；4. 切胶回收时的琼脂糖凝胶电泳，必需将电泳槽用自来水充分冲洗，其电泳缓冲液肯定要换新奇洁净的，以保证不会有其它DNA 污染；5. PCR 产物直接纯化时，扩增产物的特异性必需特别高，对于特异性差的反应，应从琼脂糖凝胶中回收目的片段，引物的长度如大于60 bp，同样要求用胶回收法来回收扩增的DNA 片段；6. 使用 PCR 产物纯化试剂盒时，模板DNA 的存在不影响下游工作，而对于质粒模板就要特殊当心；五、试验报告试验报告应包括以下内容：1. 试验目的；2. 引物设计的基本原就；3. PCR 诊断技术的基本原理；4. PCR 诊断技术的操作过程及试验结果；5. PCR 扩增及琼脂糖电泳应留意的事项；欢迎下载