第四章 细胞核移植与动物 克隆.ppt

第九章 细胞核全能性与动物克隆,第一节 细胞核全能性研究发展过程第二节 细胞核全能性的理论和研究第三节 细胞分化与发育潜能变化 第四节 动物克隆的方法,第一节 细胞核全能性研究发展过程,第一个提出对动物细胞核进行移植实验的是诺贝尔奖获得者德国胚胎学家Spemann博士，1938年提出设想“把蝾螈卵细胞核取出，然后把一个囊胚细胞核放入卵中”。但由于技术等原因，没有人能够完成这个实验。1952年，美国学者Rriggs和King利用蛙卵作出了上述实验。有些发育到蝌蚪，有些发育为成体。1958年，英国学者约翰利用爪蟾原肠内层细胞核移植，培育出成体爪蟾。1970年，用青蛙脚蹼角质化细胞进行移核实验，发育成蝌蚪。,1981年Illmensec和Hoppe用小鼠囊胚内细胞团细胞核移入去核受精卵，得到幼鼠，世界上第一例哺乳动物克隆的报道。1995年Wilmut和Campbell用经体外培养的绵羊胚胎细胞做核供体，获得第一例分化细胞克隆羊。1997年Wilmut等利用成体母羊的乳腺细胞作核供体，获得真正意义的体细胞克隆羊“多莉”。2007年美国、中国科学家克隆猕猴（灵长类），但只到胚胎，没有成体。,纯系灰色小鼠做核供体，纯系黑色小鼠为核受体。正常交配后第4天，从雌鼠中收集胚泡，去掉透明层，使内细胞团（ICM）与滋养层（TE）分离；在胰酶作用下将ICM分散成单个细胞；将黑鼠受精卵中雌雄原核吸出；将ICM细胞核移植到去核的黑色小鼠的受精卵中；胚胎在试管中培养4天到囊胚期；胚胎植入母鼠子宫中。,结果：成活3只，2雌1雄。毛色、核型及葡萄糖磷酸同工酶均于核供体表型。以后有许多学者重复这个工作，都没有成功。人们对其真假产生怀疑。事实是因为小鼠胚胎激活较早，2细胞时就有合子的基因组表达，所以去分化被认为是小鼠克隆能否成功的关键。,人类的克隆研究也正在进行中。涉及到伦理问题，所以受到限制。分为生殖克隆和治疗克隆。,我国科学家的研究（50-60年代）,1、金鱼囊胚细胞核移植到金鱼卵中。2、金鱼与其他鱼囊胚细胞和卵细胞核的交换。3、黑斑蛙成体红细胞核移入去核的未受精卵内，卵子最后发育为蝌蚪。4、鲫鱼囊胚细胞培养59代，将此细胞核移植到同种鲫鱼未受精卵中，培育出成体鲫鱼。5、将鲫鱼囊胚细胞核移植到鲤鱼去核未受精卵中，实现不同种间的核质杂交。,第二节 细胞核全能性的理论和研究,一、细胞分化是遗传物质丢失（这个观点目前看不正确） 二、分化细胞遗传物质没有发生改变   三、细胞核全能性和细胞全能性不同,一、细胞分化是遗传物质丢失,（这个观点目前看不正确）1885-1888年，Weismann和Roux等通过实验提出不同分化细胞含有的遗传物质是不同的。如用针烧蛙2细胞胚胎中的一个，结果另一个发育成半个胚胎，目前已清楚这是由于烧伤对另一个细胞有损伤。如果剧烈摇动海胆胚胎，让其解离成单个细胞，细胞都能发育为完整个体。Roux发现的马蛔虫染色体消减现象只是个别动物。,二、分化细胞遗传物质没有发生改变,1901-1903年Spemann用婴儿头发结扎蝾螈受精卵，将第一次卵裂形成的分裂球分开，结果每个分裂球都发育成一个正常而较小的胚胎。多数动物在细胞有丝分裂过程中，保证细胞核的遗传物质在2个子细胞中均等分配，子代细胞的染色体数目与遗传信息与受精卵是完全相同的。,三、  细胞核全能性和细胞全能性不同,细胞核全能性：体细胞、胚胎细胞等细胞核具有与合子核相同的全套染色体组，具有发育成一个完整个体所需要的全部遗传物质。通过核移植可以证实。细胞全能性：细胞能分化为各种细胞并形成一个完整有机体的能力。受精卵和早期胚胎。,第三节 细胞分化与核发育潜能变化,一、细胞分化和核基因差异表达 二、分化细胞与受精卵基因组的等值性,一、细胞分化和核基因差异表达,细胞分化的实质是组成有机体的不同类型的细胞合成不同类型的特异性蛋白质，即某种类型的细胞仅有部分基因被激活，约占全部基因的3-5%。真核细胞的基因可以分为2类：管家基因：在所有细胞中都表达的一类基因。奢侈基因：在不同细胞中专一的有选择性的表达。细胞分化就是这些基因表达的结果。,二、分化细胞与受精卵基因组的等值性,在细胞分化过程中发生染色体数量的变化只是个别现象。如马蛔虫。雄蜂（1n）是由没有受精的单倍体卵发育而来的。,普遍现象,分化细胞与受精卵DNA含量没有变化。如牛不同组织DNA含量：肝6.4ng，脾6.8ng，胰6.6ng，精子3.3ng。染色体数量没有变化。如Puck检查人体8种组织1825个不同类型细胞，发现除2个细胞染色体数分别为45和47外，其余为46条。基因数目没有变化。果蝇唾液腺细胞DNA链上有横带和间带，每一横带上有10个基因，果蝇基因组有5000左右横带。,结论,细胞分化没有导致细胞核的逆转。细胞核具备在适当的条件下，指导细胞发育成完整个体的发育全能性。,第四节 动物克隆的方法,clone：遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体，具有相同的遗传结构。,一、动物克隆的基本方法,1、胚胎分割法 2、细胞核移植,1、胚胎分割法,早期分裂胚经显微手术，分割为2、4、6等份，然后移植到母体子宫中。,动物的发育方式有镶嵌型发育和调整型发育。镶嵌型发育：胚胎发育的各个细胞分化过程已经确定，去掉任何一个细胞都不能发育完成。如软体动物、昆虫等。调整型发育：去掉早期胚胎的部分细胞，剩余的细胞可以调整发育方向，仍可发育为完整的有机体。如哺乳动物。,8细胞前分裂球具有全能性，每个细胞都有调整发育为一个正常个体的能力，可以分割。 囊胚至原肠胚阶段细胞紧密，细胞间相互作用加强，细胞分为内细胞团和滋养层。但分裂球仍具有调整性，可重新组合形成囊胚，但必须半胚分割。 以后，就失去调整能力,2、细胞核移植,将早期胚胎细胞、胚胎干细胞以及成体细胞等分散或培养成单个细胞，在电场的作用下或采用机械导入方法，与去核的未受精的卵母细胞或受精卵融合，发育成胚胎后，移入受体子宫。被认为是真正的动物克隆。,1990年首先在山羊的克隆上成功，西北农业大学张涌教授，两年时间克隆山羊。1995年华南师范大学，克隆牛。1995年西北农大窦忠英教授克隆猪。1996年农科院朱裕顶克隆牛。1996年湖南医科大学克隆小鼠。在胚胎干细胞核移植中我国有小鼠胚胎干细胞系、牛胚胎干细胞系等。,二、克隆动物的显微操作技术,1、主要器械和装置,显微操作仪微吸管分割器械,显微操作仪：包括倒置显微镜、左右两个操纵台、显微注射器。操纵台有 调节左右、前后和角度的粗调旋钮，还有操作手柄。先后粗调节旋钮使显微器接近胚胎，再两手操作手柄。,显微操作仪,微吸管：固定吸管、半胚吸管和注射吸管。固定吸管用来固定胚胎或卵。末端钝圆，直径与卵细胞等相当，20-30微米。过大、过小不行。半胚吸管直径能将半胚吸入为宜。尖端为直角或锐角。注射吸管用于从胚胎分离卵裂球或转移核物质，直径几微米或十几微米。,分割器械：显微玻璃针或显微分割刀。显微玻璃针用直径2-3mm的玻管拉成，针柄部50-60mm，针部40 mm，针尖20-30 mm，针柄部和针体部呈160°。显微分割刀用手术刀片或剃须刀改装磨制而成。在细油石或显微磨床上磨。显微镜下检查刀刃锋利，无缺口。刀体后端固定细柄，然后固定操作台上。,2、分割胚法,显微玻璃针分割法显微刀片分割法,胚胎分割后，一半利用原透明带，另一半装在预先制作的空透明带中。将装有透明带的分割胚植入血清中，使血清充满透明带；用1.0%和1.2%的琼脂液进行包埋；移入同期发情的中间体（小鼠等）输卵管；培养3-5天后，回收琼脂筒；去掉琼脂，检查胚胎发育情况，移入受体子宫。,3、细胞核移植,核受体胞质的准备供核细胞的准备移植胚的重构移植胚的激活培养,（1）核受体胞质的准备,受体卵的种类受体卵来源受体卵去核方法,受体卵的种类,原核期受精卵胞质、2细胞期胚胎胞质、成熟分裂（II期）卵母细胞胞质，效果好的是成熟分裂（II期）卵母细胞胞质，可以使不同时期的细胞核发生重排，进行正常发育。,受体卵来源,可以从动物体内直接获得，但数量有限。利用卵母细胞体外培养技术，获得体外成熟（IVM）的卵母细胞 。结果证明效果同体内成熟 卵母细胞。,受体卵去核方法,核是否被完全彻底的去掉；卵母细胞去核后细胞膜和细胞质是否完整；与供体核重构后发育能力。,盲吸去核法,用细胞松弛素B处理细胞。使细胞骨架松弛，质膜不易破碎。,功能去核法,用紫外线或激光照射使染色体失活达到去核目的。,化学诱导去核,用脱羰 秋水仙碱处理激活卵母细胞，使其排放第2极体，由于脱羰秋水仙碱的作用，核染色质没有分开而全部进入第二极体，完成去核。可大量去核，使克隆技术简化。,（2）供核细胞的分类及准备,胚胎细胞、胚胎干细胞和成体细胞,胚胎细胞,体外或体内发育的囊胚期前的细胞，用酶处理方法，去掉透明带，将胚胎细胞放入无Ca2+、Mg2+的PBS液中处理几分钟，用吸管吹打细胞使之解离为单个细胞。一般为几十个细胞。,胚胎干细胞,早期胚胎或原始生殖细胞体外分化抑制培养后，筛选出的具有发育全能性的细胞。细胞数量大。,成体细胞,胎儿成纤维细胞和成体动物细胞。是高度分化的细胞，能重新回到发育起始阶段，分裂发育为新的动物个体。技术上有重大突破，可无限制的克隆动物。获得细胞的过程包括组织分离、原代培养和传代培养、诱导归零。,以乳腺为例：消毒体表后，无菌采集1g乳腺实质组织，放入培养液中，用Hank液洗3次，洗去血迹等，剥离结缔组织、脂肪组织。用眼科剪子将乳腺剪成1mm3，用1640培养液（加入氢化考的松等生长因子）培养，也可采用消化法。原代建成后，继续传代培养。然后降低血清浓度（10%-0.5%，血清饥饿法）造成营养缺乏，进入G0期，此时可进行核移植。,G0期细胞是一种暂不增殖又保持着分裂潜能，在一定条件下可恢复增殖能力的细胞。通过饥饿法，使细胞进入G0期，同步后融合，有利于胚胎正常发育。体细胞大多停留在G0。胚胎早期细胞停留在S和G2期，卵细胞在第二次成熟分裂中期。细胞周期不同使形成的胚胎发生DNA的额外复制，提早复制的染色体导致非整倍体及胚胎的异常发育。,体细胞克隆的生物学意义,获得遗传上同质的后代，对动物细胞生物学、遗传学等研究有重要的理论意义和研究价值。 在畜牧生产中，可以使遗传性状优良的个体在群体中大量增殖，加速动物育种和品种改良进度。,体细胞克隆的生物学意义,在医学上为干细胞生产、人类器官复制、遗传疾病的治疗开辟一条有意义的途径。 在培育供体细胞成为核供体时，可以利用基因技术改变核基因或转入目的基因，产生基因克隆体。 将经过性别鉴定的胚胎进行克隆，可获得大量期望性别的动物。,（3）移植胚的重构,直接注射法 带下注射法,直接注射法,利用注核针吸入供体核后，直接刺破受体卵质膜，将核注射入受体细胞质中。直接注射法对卵膜和细胞质损伤较大，容易造成细胞死亡。,带下注射法,将核供体细胞注射到卵周隙中，进行细胞融合处理，避免对卵膜的损伤。常用。,（4）移植胚的激活,电融合过程本身有激活作用。电激活 给重组胚电刺激。化学激活 加入7%乙醇、离子霉素等。,（5）培养,在培养液中培养，观察分裂情况,四、克隆动物存在的问题,成功率很低，只在少数国家和动物有成功的例子，需进一步完善操作程序；克隆动物畸形率高，畸形程度与供核细胞的分化程度有关；生产效率低，早期胚胎流产率高；妊娠时间长，出生后体重过大，对环境适应性差。差。,讨论：从技术和伦理方面分析人克隆的可行性和意义。,