华南师范大学实验报告.doc

- 1 -华 南 师 范 大 学 实 验 报 告学生姓名学生姓名 林 鸿 锦 学学 号号 20070004002 专专 业业 综合理科二班 年级、班级年级、班级 07 级 课程名称课程名称 生物化学实验 实验项目实验项目Folin-Wu 法测定血液葡萄糖含量 实验类型实验类型 验证验证 设计设计 综合综合 试验时间试验时间 2008 年年 11 月月 10 日日实验指导老师实验指导老师 陈 文 利 实验评分实验评分 一、目的学会用 Folin-Wu 法测定血液中葡萄糖含量。二、原理葡萄糖的半缩醛羟基具有还原性，在加热条件下可使碱性铜试剂中的 Cu2+还原为黄色 的氧化亚铜沉淀，而其本身被氧化为羧基。氧化亚铜可使磷钼酸还原成蓝色的钼蓝，蓝色 的深度与葡萄糖的浓度成正比，故可用比色法测定钼蓝的光吸收值来测定葡萄糖的浓度。3Cu2O + 2MoO3 6CuO + Mo2O3 (氧化亚铜) （钼蓝）血糖即指血液中存在的葡萄糖。由于血液中成分复杂，尤其有许多种蛋白质存在，它 们对血糖的测定会产生干扰。因此，目前常用钨酸法处理抗凝血来制备无蛋白滤液，然后 用来测定无蛋白滤液中的葡萄糖含量。Na2WO4 + H2SO4 H2WO4 + Na2SO4 (钨酸钠) （钨酸）在测定过程中，由于空气中的氧对 Cu2O 会产生再氧化作用从而影响 测定结果，因此实验中要采用特制的福林吴宪血糖管有一细颈， 可以尽量减少与空气的接触（如右图） 。三、材料、试剂和器具（一）（一） 材料材料饥饿 16h 的鸡。（二） 试剂试剂（实验室已制备） Folin-吴宪式血糖管1、10%钨酸钠溶液 2、1/3mol/L 硫酸溶液 3、标准葡萄糖溶液（0.1mg/mL）4、碱性铜试剂 5、磷钼酸试剂 6、草酸钾（A.R）（三）（三） 器具器具1、 烧杯 2、 试管及试管架3、 玻璃棒 4、 Folin-吴宪式血糖管- 2 -5、 小漏斗 6、 可见光分光光度计7、 移液管 8、 电炉四、实验过程（一）（一） 制备无蛋白滤液制备无蛋白滤液1、 杀鸡取血后立即按 2g 草酸钾/L 血液的比例加入草酸钾，以制备抗凝血。 2、 取一支试管加入 7.5mL 蒸馏水。 3、 用移液管量取 0.5mL 抗凝血。小心擦去管外血液后，于试管底部缓缓放出血液。吸取 试管内蒸馏水吹洗吸管数次后，充分摇匀，使血液完全溶血。注意不要使血液粘附于 移液管管壁。 4、 加入 1/3mol/L 硫酸溶液 1mL，边加边摇，摇匀后放置 5min。 5、 过滤、收集滤液。由于第一次滤液不清，于是重新过滤，直到滤液澄清。至此，所制 得的无蛋白滤液为 20 倍稀释的无蛋白血滤液，即每 mL 血滤液相当于含血 0.05mL。（二）（二） 血糖的测定血糖的测定取血糖管 3 支，编号后按下表操作。 （单位：mL）血糖管编号1（空白管）2（标准管）3（测定管）蒸馏水2.0-无蛋白血滤液-2.0标准葡萄糖液-2.0-碱性铜溶液2.02.02.0混匀，沸水浴中煮 8min，勿摇动取出，流水冷却。溶液颜色蓝色（无 Cu2O 生成）黄色（生成 Cu2O）黄绿色（Cu2O 较少）磷钼酸试剂2.02.02.0蒸馏水19.019.019.0充分混匀。溶液颜色无色（无 Mo2O3生成）深蓝色（生成 Mo2O3）蓝色（Mo2O3较少）A62010.0000.4630.283A62020.0000.4600.280平均值0.0000.4620.282比色杯误差0.0000.001-0.007修正值0.0000.4610.289（三）（三） 血糖浓度计算血糖浓度计算1 . 0 100mgAAmgmL100 620620数标准葡萄糖标准管测定管数血液所含葡萄糖每公式分析：（1）式中 0.1 表示 2mL 血滤液相当于 0.1mL 全血，即 2mL 滤液所含葡萄糖- 3 -mg 数/0.1=1mL 全血所含葡萄糖 mg 数。 （2）测定管 A620/标准管 A620=2mL 滤液所含葡萄糖 mg 数/2mL 标准葡萄糖 mg 数。 （3）要求的是酶 100mL 全血所含葡萄糖 mg 数，所以乘以 100。 综上，可得到上面的公式。将数据代入公式，则每 100mL 鸡血所含葡萄糖 mg 数=（0.289/0.461） ×0.2×（100/0.1）=125.4mg。五、实验讨论（一）注意事项（一）注意事项21、 欲得准确结果,所取血液的量必须准确。如果由吸管中放出血液的速度太快,会有大量 血液粘在吸管内壁,容量不准,所以一般放出 1mL 血液所用的时间不应少于 1min。 2、 沉淀由鲜红变为暗棕色,是因钨酸钠与硫酸作用生成钨酸,在适当酸度时,使血红蛋白变 性,沉淀。如血沉淀放置后不变为棕红色或重滤后仍混浊,可在钨酸与血混合液中加入 10%硫酸 12 滴,待变为暗棕色后再滤。（二）本实验中新鲜鸡血为什么要加入草酸钾？（二）本实验中新鲜鸡血为什么要加入草酸钾？3血液凝固是一系列生物化学的结果，其最后阶段是血浆中的一种可溶性的纤维蛋白原 转化为不溶性的纤维蛋白。参与凝血反应的物质统称为凝血因子，其中绝大部分属于蛋白 质类，但也有小分子物质，如钙离子（Ca2+）在血液凝固过程中起重要作用，缺乏则血液 不能凝固。化学物质草酸钾（或草酸铵）溶液能与血液中的钙离子发生发应，形成草酸钙 沉淀，因此能起到抗凝作用。另外，柠檬酸钠也可与血液中的钙离子发生发应，结合成不 易电离的络合物，防止血液凝固。（三）本实验采用的（三）本实验采用的 Folin-WuFolin-Wu 法测定血液中葡萄糖的含量，是一种比较老的测定方法，其法测定血液中葡萄糖的含量，是一种比较老的测定方法，其缺点是显而易见的，例如需要制备无蛋白血滤液，操作麻烦，时间过长，而且其特异性不缺点是显而易见的，例如需要制备无蛋白血滤液，操作麻烦，时间过长，而且其特异性不高。那么，有没有更好的实验方法呢？高。那么，有没有更好的实验方法呢？ 41、葡萄糖氧化酶法 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)利用氧和水将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放 过氧化氢。过氧化物酶(peroxidase，POD)在色原性氧受体存在时将过氧化氢分解为水和氧， 并使色原性氧受体 4-氨基安替比林和酚去氢缩合为红色醌类化合物，即 Trinder 反应。红 色醌类化合物的生成量与葡萄糖含量成正比。 2、邻甲苯胺法 在热的醋酸溶液中，葡萄糖醛基与邻甲苯胺缩合、脱水，生成希夫氏碱(Schiff base)， 经分子重排生成蓝绿色化合物，其颜色深浅在一定范围内与血糖浓度成正比。蓝绿色化合物希夫式碱葡萄糖基胺葡萄糖邻甲苯胺比较这两种方法的优缺点：方法优点缺点邻甲苯胺法易于操作，特异性高邻甲苯胺腐蚀性、刺激性较高，且有毒性葡萄糖氧化酶法更易操作，无毒无刺激成本较高，试剂易污染，可操作性低【参考文献】1许秀珍，梁山.生物化学与分子生物学实验指导M.广州：暨南大学出版社，2003.82- 4 -842 http:/zhidao.baidu.com/question/1885748.html?si=1 3 http:/zhidao.baidu.com/question/40059029.html?si=2 4 http:/www.bbmc.edu.cn/jpkc/2007/lcswhx/shyjx/shjc/09.doc