拟南芥对蓝光响应的隐花色素.doc

【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流拟南芥对蓝光响应的隐花色素.精品文档.拟南芥对蓝光响应的隐花色素（CRY2）核小体的形成与CRY2的蓝光依赖性退化有关摘要：拟南芥隐花色素（CRY2）对花萌发的光周期有促进作用，对蓝光下胚轴伸长有抑制作用。据推测，由于光激发，CRY2的C -末端从N -端PHR的域脱离，从而形成cry2的去阻遏。为了检验这一假设，我们分析了绿色荧光蛋白（GFP）与CRY2在N端或者C端融合的活性。GFP - CRY2发挥光依赖的生化和生理活动与内源性的CRY2相似，而CRY2-GFP表明这两个基因生化和生理活动的组成性。CRY2 - GFP是结构性磷酸化，它促进了黑暗和光下的去黄化，并激活的长日照和短日光照花芽分化。这些结果与假设是一致的，即光激发致使CRY2的C -末端从PHR域脱离，并激活CRY2。令人惊讶的是，我们发现，CRY2-GFP，形成了独特的蓝光响应核小体，而不是GFP - CRY2。与GFP- CRY2或内源性的CRY2相比，CRY2-GFP的降解使其对蓝光的应答显著变缓，这表明核小体的形成是由于光激发未降解的CRY2-GFP的积累。根据这一解释，我们发现，在26S-蛋白酶抑制剂（能够阻止蓝光依赖性的CRY2降解）的存在下， GFP- CRY2和内源性CRY2 形成了核小体。引言隐花色素是蓝光受体，介导植物和动物的生长发育及其生物钟的光调节。拟南芥隐花色素CRY1和CRY2的主要功能分别是调解蓝光下胚轴伸长和促进花芽分化的光周期，虽然两个光受体的功能也有重叠。隐花色素有两个域，负责光吸收的N端PHR域（光修复酶同源区），和可能充当效应结构域的C端区域。相关的隐花色素光活化的分子机制还不十分清楚。几个有趣的假说被提出来，解释了在拟南芥中隐花色素的早期信号转导过程的不同方面。这些研究表明，涉及隐花色素的植物信号转导的早期阶段与几个不同的分子反应有关。例如，隐花色素黄素生色团的光还原反应（完全氧化的FAD到中间激发态FADH）与他们的生理活动有关。另一方面，光激发的隐花色素分子可能结构发生改变，以触发其磷酸化，从而导致它与其它信号蛋白在一个开放的构象中互作来调节基因表达和反应，最终导致光受体的泛素/ 26S蛋白酶体的降解。然而，开放构象假说提出了主要基于敲除隐花色素的转基因植株中表达融合蛋白片段的研究，并没有证实存在隐花色素同源蛋白。大多植物的隐花色素是核蛋白质。拟南芥CRY1的表达产物穿梭于细胞核和细胞质之间，并在两个位置起作用。而CRY2在细胞核中完成其翻译后的生命周期。然而，CRY2在细胞核哪个部位履行其功能和/或修饰与降解仍不清楚。据发现，CRY2与红色荧光蛋白在烟草的原生质体中瞬时表达形成了斑点，也认为是核小体。由CRY2-RFP形成的核小体在形态上与红色/远红光受体光敏色素A和光明色素B的核小体类似。CRY2和phyB在光依赖性核小体里互作，支持了两感光受体功能相互依存的方式起作用的假设。另一方面，它也知道，E3泛素连接酶COP1与GUS-CCT1（C端CRY1域）的融合蛋白相互作用。像哺乳动物细胞泛素/蛋白酶体结构的某些成分，拟南芥COP1能够形成核小体和吸收GFP-CCT1进入到核小体。可以猜想，隐花色素，光敏色素，和COP1可能通过同如被定义为核小体的超级蛋白复合物协作而产生互作。然而，CRY2的亚细胞定位和功能/调节的关系似乎更复杂。例如，据报道，在拟南芥中内源性的CRY2和瞬时或稳定表达生理活性的GFP-CRY2和GFP - CRY1融合蛋白没有核小体形成。此外，无论COP1与CRY2特异互作，还是作为CRY2的主要E3泛素连接酶仍存在争议。 在白化苗暴露于蓝光下，CRY2是被泛素化且被26S蛋白酶体降解，但在E3泛素连接酶在这个过程所起的作用尚不清楚。虽然在两个cop1的弱等位基因突变体中（cop1-4 and cop1-6），CRY2依赖蓝光性降解受到抑制，但是CRY2仍然会在COP1无效突变体（COP1- 5）中降解。这些结果表明，需要有更多的研究来阐明伴随着CRY2感光体不同的生化反应的亚细胞定位和与相关机制。为了证实隐花色素同源蛋白构象假说，我们研究了两个融合蛋白，CRY2-GFP和GFP-CRY2。令我们惊讶的是，我们发现CRY2-GFP ，而不是GFP-CRY2 ，在暴露于蓝光下的白化苗中形成明显的核小体。CRY2-GFP 形成核小体的反应与融合蛋白对蓝光应答而产生的降解的延迟相关。结果显示，不形成核小体的GFP-CRY2在26S蛋白酶抑制剂抑制的存在下形成核小体。此外，我们还观察到明显的不同，虽然在蓝光应答下，内源性CRY2形成核小体相对薄弱，但是，在蛋白体抑制剂的存在下，内源性CRY2形成核小体明显增强。我们推测，cry2核小体可能是与光受体的蓝光诱导降解有关的超分子复合物。结果CRY2-GFP（GFP与CRY2的C端融合）抑制光受体的生理活动基于利用截断隐花色素片段在转基因植物中表达的研究，光诱导开放构象假说被提出来解释拟南芥隐花色素分子如何应答蓝光。根据这一假说，PHR和一个非磷酸化隐花色素的C -端区域，如CRY2，互作形成一个封闭的构象，这个构象是在黑暗条件下是无活力的。吸收光子后，隐花色素的C -末端结构域磷酸化且产生静电排斥，或从PHR的域表面脱离。这形成一个开放的构象，导致感光受体受到抑制。由于CRY2的辅助的C -端区域相对较小，本质非结构化，我们推测，报告蛋白，如GFP，附着到CRY2的C-端，辅助黏住C -端的域，将其从PHR域拉下来，造成黑暗条件下的无活力根据公开的构象假说，我们进一步推断，这种融合蛋白可能是组成型活性。为了检验这种可能性，我们比较表达GFP-CRY2或GFP-CRY2的转基因植物光形态反应。在突变体cry1cry2的背景下，表达GFP-CRY2 的植物呈现出辅助蓝光和长日照（LD）的依赖性光形态建成（图1，图2）。GFP-CRY2 的转基因表达，拯救了突变体cry1 cry2亲本 蓝灯诱导特异长下胚轴（图1B to 1D）和长日照诱导特异晚花（图2A和2B）的表型。GFP-CRY2，CRY2-GFP 的对比表明，在相同的遗传背景蓝光和长日照的活动是独立的。CRY2-GFP/cry1 cry2 植物的表型与表达GUS-CCT2 、GUS-NC80的 转基因植物或者cop/det 的突变体表型相似。在所有的测试条件下（包括蓝光，红光，远红光，暗），CRY2-GFP/cry1cry2的幼苗发育成短的下胚轴和膨大的子叶（图1B to 1D;，见参考图2在线）。CRY2不依赖蓝色光的活性不是由于一个不寻常的高表达水平，因为转基因株系中没有一个株系高于CRY2- GFP的测试水平（图1A高，见参考图1网上），这意味着CRY2-GFP将CRY2从一个依赖于蓝光的光受体转变成不依赖于蓝光的具备生理活性的蛋白。与这概念一致的是CRY2- GFP是组成型的，在光反应中正常表达的基因也会在黄化苗中表达。在缺乏光线条件下，CRY2-GFP/cry1 CRY2的仍显示质体的发育（图1F）。例如，黄化野生型细胞与cry1 cry2 突变体幼苗的细胞显示具备prolamellar结构和缺乏内部膜的典型的白质体状图1F，野生型（D）条。短暂的蓝光照射刺激内部膜发育图1F，野生型（b）。与此相反，在完全黑暗条件下，突变体cop1幼苗的白色质体表现出更多的先进的内部膜堆叠和prolamellar结构的缺乏，仿佛突变体是在光下生长图1F，cop1（d）。同样，表达CRY2-GFP 的白化幼苗细胞也有显著的膜发育，包括圆形，堆叠，内膜增厚结构图1F，CRY2- GFP- 2（D）和CRY2-GFP-3（D）。图1：CRY2-GFP在无蓝光情况下抑制下胚轴伸长，而GFP - CRY2的抑制作用需要蓝光（A）GFP-CRY2 和CRY2-GFP 融合蛋白表达在三个独立的各基因型株系水平测试。从5 d的黄化苗提取总蛋白质。被探测的免疫抗CRY2，分离并与抗泡焦磷酸酶（vPPase）再杂交。（B）指示基因型幼苗的下胚轴长度。幼苗5天生长在黑暗中或在连续蓝光（35.6 µmol m-2s-1），红光（9.8µmol m-2s-1），或远红光（3µmol m-2s-1）。误差线显示标准差（n 20）。（C）关于在（B）所使用的基因型代表幼苗比较。（D）对三个独立表达CRY2- GFP的蓝色光下连续种植5天转基因株系进行了分析。如图所示的胚轴长度和标准差（n 20）。(E)采用RT - PCR检测显示CAB3和CHS基因，通常不会在6 天的黄化野生型、cry1 CRY2或GFP - CRY2苗中表达，而在CRY2- GFP和COP1-6的 6 d黄化苗中高度表达。 UBQ表达的是作为对照组。（F）透射电子显微镜（TEM）图像显示在基因型6 d的黄化苗质的发展变化。D，黄化苗; B，一个简短的蓝光照射（100秒; 104µmol m-2s-1）。除了幼苗生长发育不依赖蓝光的活力，CRY2-GFP 还具有成株不依赖光周期活力。在与GFP-CRY2/cry1 cry2 拯救晚花对比，长日照下cry1 cry2 亲本的表型在短日照条件下对开花时间没有显著的影响，无论是在长日照还是短日照条件下，GFP-CRY2/cry1 cry2 的开花时间都要比cry1 cry2 亲本的早。由于突变体cry1 cry2在长日照而不是短日照下延迟开花，CRY2-GFP/cry1 cry2 在短日照下加速开花代表了增益功能型表型。该CRY2- GFP的活性是不依赖内源性CRY2的，因为相同的增益功能表型是在CRY2 GFP/cry1植物中观察到（见参考图3和4在线）。图2（左边）。光周期独立CRY2- GFP的活性调节开花时间。(A) 40或60天龄的基因型植物分别在长日照（16 小时光照/ 8 小时黑暗）或短日照（8小时光照/16小时黑暗）中生长。有些植物捆绑在一起，以更好地显示在单独的盆中。(B) 开花期根据开花时间或莲座叶在开花期的数量测量 。 图3（右边）。光依赖的CRY2、GFP-CRY2,和 CRY2-GFP的构象变化模型。CRY2的PHR域的结构进行了计算建模，与已知的CRY1的 PHR域的结构不一样。表面拓扑结构和静电势（红色，带负电荷，蓝色，带正电荷）已经显示。该CRY2的辅助C端结构域被武断提出。绿桶描绘绿色荧光蛋白。红色圆圈描绘的CRY2 C -端结构域的磷酸化残基。由于CRY2- GFP和GFP-CRY2都包含 CRY2的全长序列，并且CRY2-GFP 蛋白的稳态水平不比GFP-CRY2的高（图1A，见参考图1网上），CRY2- GFP不依赖蓝色光及光周期独立的活动可以被解释了，GFP附着到CRY2的C端引起了CRY2-GFP 类似于光激发CRY2的构象变化（图3）。然而，CRY2-GFP 似乎保留光响应。 在光线下CRY2-GFP 呈活性增加，无论光的波长和能量密度率（图1D，见参考图2在线）。这种现象是组成型融合蛋白GUS - CCT2和GUS - NC80的影子，和突变COP1一样不含有 PHR 生色团结合域。可想而知，这光效是由CRY2- GFP和光敏色素或COP1的互作引起的。CRY2-GFP是组成型磷酸化众所周知，CRY2是蓝光依赖性磷酸化。据推测，光激发改变CRY2的构象进而引发的磷酸化，并带来了进一步的构象变化，激活感光受体最终启动其泛素化和降解。根据这一假说及以上讨论的观点，CRY2-GFP引发一个类似于光激发CRY2的构象改变，一种可能期望是组成型磷酸化。因此，我们研究了CRY2-GFP 磷酸化在cry1或cry1cry2突变体背景表达。这些突变体表现出类似的表型（图1，图2，见参考图3和4在线），但CRY2-GFP/cry1突变体同时允许都检测CRY2-GFP和内源性CRY2。事实上，虽然蓝光增强磷酸化反应（图4B），但是CRY2- GFP融合蛋白的确显示构磷酸化（图4A和4B）。由于CRY2是多个丝氨酸残基的磷酸化，CRY2- GFP 磷酸化的影响构成部分是可以想象的 ，而不是全部丝氨酸残基，使得CRY2的磷酸化是在蓝光仍略有增加。有趣的是，在表达CRY2-GFP 的转基因苗（cry1的突变体背景）中内源性CRY2也成为组成型磷酸化（图4a和4b）。CRY2- GFP究竟如何影响内源性CRY2磷酸化仍不清楚。然而，由于隐花色素通过PHR域形成二聚体，可以猜想CRY2-GFP 磷酸化可能与内源性CRY2互作，使内源性CRY2在黑暗中磷酸化。此外，目前还不清楚，CRY2-GFP 本身是否可能作为激酶。虽然CRY1已被证明在体外自磷酸化，而CRY2自磷酸化还没有被成功证实。因此，无论CRY2-GFP 直接或间接导致的内源性CRY2反磷酸化还然而，调查结果显示，GFP-CRY2 仍然是依赖光的磷酸化和生理反应，而假定CRY2-GFP 是光依赖磷酸化和生理活动来支持这一假设，光激发改变CRY2的构象并激发它的活性。有待进一步研究。图4。GFP- CRY2和cry2 - GFP融合蛋白的蓝光依赖性磷酸化和降解。(A)和（B）暴露于蓝光(26µmol m-2s-1 ）6 天的黄化苗在体内磷酸化为15分钟。两个独立的实验结果显示。对于GFP-CRY2 （即B右半边）的结果曾作为一个对照标准被发表。括号和星号分别代表CRY2-GFP（或GFP - CRY2）和内源性CRY2。（C）免疫印迹显示5 d蓝光照射 (14µmol m-2s-1 )的黄化苗的GFP - CRY2和cry2 - GFP 的水平。（D）及（E）代表免疫印迹显示，从在黑暗中生长或持续蓝光下生长（2µmol m-2s-1）5天的种苗表达GFP-CRY2 或CRY2-GFP的 蛋白样品中系列稀释。在免疫印迹进行与抗CRY2杂交，分离并与抗焦磷酸酶抗体再杂交，或与丽春红S染色显示相对负荷。Xd表示稀释倍。在应答蓝光时CRY2- GFP的显示延迟降解鉴于CRY2磷酸化需要CRY2的泛素化、CRY2的降解，并且与GFP-CRY2 相比，CRY2-GFP是磷酸化（图4B），可以推测，在蓝光应答下甚至没有蓝光下，CRY2-GFP 降解反应比GFP-CRY2 快。令我们惊讶的是，在黄化苗暴露于蓝光下，CRY2-GFP 的降解速度比GFP-CRY2 慢（图4C）。黄化苗露于蓝光下，GFP-CRY2 呈现出与内源性CRY2相似的30min半衰期。相比之下，CRY2-GFP呈现了长于4h的半衰期（图4C）。在暴露于蓝光的白化苗中，CRY2- GFP延迟降解，不是因为CRY2-GFP 的表达水平比GFP-CRY2 更高，这表明CRY2- GFP 见光不稳定。图5。 CRY2-GFP形成对蓝光的响应核小体，而不是 GFP-CRY2。（A）和（B）的荧光图像显示GFP-CRY2（A）或CRY2-GFP (B)核分布。GFP的荧光图像拍摄是从白化苗中分离出暴露于蓝光（22µmol m-2s-1 ）的时间B（min）的细胞核（7日龄），光照处理后，立即由4甲醛固定并显示。（C）CRY2-GFP的核小体通过绿色荧光蛋白与cry2结合的荧光显示。黄化苗暴露于蓝光15分钟（20µmol m-2s-1）并由4甲醛固定，分离出的细胞核与抗CRY2抗体和若丹明红- X的标记的羊抗兔IgG抗体进行了杂交。标线 = 5 µm。有人注意到，在暴露于蓝光的黄化苗中，虽然 CRY2-GFP 的降解速度比GFP-CRY2 慢，但在连续蓝光下生长的苗中，CRY2-GFP 的积累的量并不比GFP-CRY2 高。这个令人困惑的结果让我们想起了之前报道的野生型植株内源CRY2的另一个观察结果。结果发现，在萌发芽及在蓝灯下生长5天的幼苗中检测到大量的CRY2，然而在暴露于同样的能量密度蓝光下4h的5天黄化苗中，CRY2 降解到检测不到水平。结果表明，存在一个反馈机制，抑制蓝色光依赖的CRY2的泛素化和/或长时间蓝光照射下CRY2的降解，并且CRY2-GFP 是受到与内源性CRY2相同的反馈调节。仍然令人费解的是，虽然CRY2的磷酸化据报道是需要感光受体的生理活性和降解，但是为什么磷酸化的 CRY2- GFP 促进了生理活性却减少了降解仍不得而知。这种差异的一个可能的解释将是对生理活动相关的结构元素与CRY2的泛素化和降解所需的结构元素不完全相同。换句话说，由于 GFP 附着到CRY2的C端而产生的构象变化可能允许在没有光线下的磷酸化和活动，但它在某种程度上抑制了泛素或/和CRY2- GFP的降解。该假说推测，CRY2将与不同的蛋白质在光激发CRY2的同源蛋白的不同位置相互作用，其中一些需要进行CRY2的功能，而其他的用来CRY2的泛素化和降解。这些蛋白质鉴定后，这个假设可能被验证。CRY2- GFP的形成对蓝光响应的核小体暴露于蓝光黄化苗的活细胞中，GFP-CRY2和cry2 - GFP的表现出截然不同的亚核分布（见在线版）。在这个实验中，黄化幼苗置于荧光显微镜，曝光时间30s。样品然后被蓝灯（490 nm）激发，在荧光激发后，GFP 的放射荧光的荧光图像，在每秒两次的速度抓拍。在20秒的荧光激发下，CRY2- GFP融合蛋白开始形成核小体，GFP的荧光被曝光后，而这些核小体在100秒内才可见（见在线版）。这些GFP-CRY2 核小体形态与以前烟草报道瞬时表达CRY2-RFP 的原生质体或者是拟南芥表达phyB-GFP 和 phyA-GFP 的原生质体相似。然而，与CRY2- GFP不同的是，GFP-CRY2融合蛋白留在核质，表明在整个实验（见在线版）没有核体的形成。图6。改变蓝光下CRY2- GFP核小体的密度。（A）定量分析显示在不同时间蓝光照处理幼苗的CRY2- GFP每核核小体的焦点区域的数量变化。表示了不同蓝光（32µmol m-2s-1）照射时间（min）的黄化苗由甲醛固定而从细胞核中分离。每个样本至少有120个核小体，每核的核小体焦点区域用一定数量的百分比计算显示。（B）CRY2- GFP核小体作为在（A）的准备从黄化幼苗暴露于蓝光（32µmol m-2s-1）2小时，显示了较大的规模和经过长期蓝光照射的核小体变量形态。绿色荧光蛋白的荧光图像显示在左侧；用4',6二脒基-2-苯吲哚盐酸染色绿色荧光蛋白的荧光合并图像是显示在右侧。标线 = 5 µm。为了进一步详细分析这个现象，我们将种苗在不同光线条件下生长并用甲醛固定，从中提取细胞核，再研究GFP-CRY2 和CRY2-GFP。这种方法使我们能够在没有任何荧光激发的影响下，捕捉荧光显微镜下CRY2- GFP或GFP-CRY2的图像，用于观察GFP的光的干涉。如图5所示，从黄化苗中分离出细胞核展出了核质中GFP-CRY2 和CRY2-GFP 的近均匀分布（图5A和5B，0分钟）。暴露在蓝光白化苗中，GFP - CRY2的亚核分布仍然不变（图5A，1和120分钟），但CRY2-GFP 形成核小体（图5B，1和120分钟）。在活细胞中观察一致（见参考电影在线），在蓝灯照明后，CRY2- GFP的核小体迅速形成（图5b）。蓝光照射后1min内，CRY2- GFP的核小体显然是（图5B，1分钟）可见的；一延长蓝光处理，幼苗的个体变大，但在对CRY2- GFP的核小体数目减少（图5B，120分钟）。一个免疫实验证实，CRY2- GFP的核小体是由融合蛋白形成，但不是GFP蛋白片段（图5c），并且他们不是CRY2- GFP融合蛋白的聚集到致密的异染色质中心（图5B和5C条）。一个免疫实验证实，CRY2- GFP的核小体是由融合蛋白形成，但不是GFP蛋白片段（图5c），并且他们不是CRY2- GFP融合蛋白的聚集到致密的异染色质中心（图5B和5C条）。图7。CRY2- GFP核体形成的速率反应。 用甲醛固定的7 日龄的幼苗表皮细胞暴露在蓝光（0.590µmol m-2s-1）下30秒的CRY2- GFP的荧光图像。 图8。核染色显示内源性蛋白CRY2和CRY2- GR的融合蛋白的核小体。（A）染色显示14天龄的野生型幼苗的内源性CRY2核小体，在连续红光（10µmol m-2s-1）下生长和蓝光（10µmol m-2s-1）下照射15分钟的情况。从叶组织分离出细胞核用甲醛固定，抗CRY2的抗体与抗兔IgG杂交，并用罗丹明红色-标记。（B）免疫染色显示了CRY2- GR融合蛋白的核小体。转基因株系CRY2- GR在含地塞米松30mM的MS培养基中生长，在连续红光（10µmol m-2s-1）照射和蓝光（10µmol m-2s-1）照射15分钟。DAPI染色荧光图像显示了抗CRY2抗体，用罗丹明红色-X标记羊抗兔IgG，两图合并后的显示图像。框内的图像被放大2.2倍显示。标线 = 5 µm。通过定量分析证实了在蓝光的反应中CRY2- GFP核小体形成的动态过程（图6a）。在这个实验中，我们将白化苗在蓝光下照射0.5至60分钟并甲醛固定，从中提取细胞核，再定CRY2- GFP 的数量。在暴露于蓝光的黄化苗中，大部分细胞核可以观察到10至40（每核聚焦区）核小体（图6A，0.59和19个蓝色）。相比之下，延长蓝光照射出力，幼苗大部分细胞显示少于20核小体（每核聚焦区）和分布范围较窄。例如，用蓝光幼苗5照射分钟或更长时间，大多数细胞核存在20或更少的核小体（每核聚焦区域）（图6A，59，309和609蓝），虽然一个未知原因的明显比例细胞核含有更多的核小体单一高峰（图6A，309和609蓝）。有趣的是，虽然暴露于蓝光较长时间的细胞呈现每核CRY2- GFP核小体数量越少，但核小体变得更大，形态更多样（图6b）。为了检查的CRY2- GFP的核小体形成对注量率的反应，我们将黄化苗暴露于不同注量率蓝光下，照射为30秒的，光照处理后立即固定在5甲醛，分离出细胞核，并在荧光显微镜下分析了CRY2-GFP。图7表明，当注量率低于14 mol m-2s-1，蓝光照射 30秒后，幼苗几乎不可见CRY2- GFP的核小体（图7，0到7）。相比之下，注量率较高（90 mmol m22s21）的蓝色光线照射幼苗30秒，可以看到清晰的核小体（图7，90）。综上所述，我们得出的结论是CRY2GFP的核小体的形成是一个蓝光依赖的过程。蓝光的响应中，内源CRY2和CRY2- GR的融合蛋白也构成核小体事实上， 是CRY2-GFP，而不是GFP-CRY2，表现出蓝光诱导形成核小体的形成，从而提出的问题是否因两个融合蛋白结构的差异造成CRY2- GFP的核小体代表实验人工品。为了探讨这一问题，我们通过免疫染色重新审视响应蓝光的内源性核CRY2的分布（图8）。在这个实验中，我们将在红光生长的苗暴露在蓝光下，甲醛固定组织，并将细胞核与抗体CRY2杂交检验。比起CRY2- GFP，明显更难检测到内源性CRY2核小体。然而，仔细检查发现了与蓝光照射野生型植物细胞虽小，但相当比例的确含有CRY2核小体（图8，在线见参考图5）。核小体幼苗（图8）和成株（见参考图5在线）都有发现。图9。蓝色光诱导的蛋白酶抑制剂存在下的GFP - CRY2或内源性CRY2的核小体。（A）荧光图像显示了用蛋白酶抑制剂（蛋白酶体抑制剂MG132和MG115）处理的连续红光（10µmol m-2s-1）下照射和蓝光（20µmol m-2s-1）照射为15分钟的GFP-CRY2融合蛋白的幼苗核小体。标线 = 5 µm。（B）连续红光照射的野生型内源性CRY2植株中用蛋白酶体抑制剂MG132或MG115 处理的免疫染色。标线 = 5 µm。（C）在连续红光下生长并用MG115或MG132抑制剂处理，然后照射15分钟蓝光（20µmol m-2s-1）的野生型内源性CRY2植株的免疫染色。标线 = 5 µm。在含有清晰可辨的核小体的细胞核的百分率方面，转基因苗CRY2- GFP（7080）要高于野生型CRY2 （20至30）。内源性CRY2每核核小体要比 CRY2-GFP 的每核核小体少。这可能是由于野生型植株内源CRY2相对较低的水平（见参考图1网上），这两种不同荧光基团不同的光学特性，和/或CRY2和它的GFP融合蛋白的整体结构不同。然而，内源性CRY2核小体对特有的蓝光才形成（图8），其亚核的定位和形态与CRY2- GFP相比有根本上的不同。（图8，见参考图5在线）。在地塞米松的存在下也观察到了蓝色光依赖的核小体CRY2-GR 融合蛋白存（图8，见参考图5在线）。CRY2- GR核小体检的平均粒径，密度和对测频率与内源性CRY2相似，但比CRY2-GFP低。这是因为在本实验所用CRY2- GR的株系（在cry1cry2突变背景）专门挑选来表达 CRY2-GR ，其表达水平与野生型植株的内源CRY2媲美。综上所述，认为 这些观察强烈地认为CRY2- GFP的核小体不是实验人工制品，而且蓝光应答时核小体的形成是感光受体CRY2内在属性。CRY2核小体的形成伴随着CRY2的降解如果蓝光响应核小体的形成是一个CRY2的内在属性，为什么只有CRY2-GFP，而不是GFP-CRY2，呈现易被观察的核小体（图5，见参考在线电影）？一个可能的解释是，因为CRY2-GFP 是降解速度比GFP-CRY2慢（图4d），通常CRY2降解在亚核区，CRY2- GFP的延迟降解可能迫使它在亚核区积累。因此，这两个在核小体形成的融合蛋白的不同活性可能是由于其不同的降解率。换句话说，CRY2- GFP的核小体可能是一个内源性CRY2内在属性的夸大表型。我们推测，如果CRY2- GFP和GFP-CRY2 在核小体形成的活性的差异是由于各自不同的降解率，如果GFP-CRY2 核蓝光依赖的降解受阻，其也应形成核小体。为了检验这种可能性，幼苗在红光下生长，然后蓝光（为20 mmol m22s21）照射15分钟，接着用或不用抑制蓝色光致降解的26S蛋白酶体抑制剂MG115或MG132处理。幼苗蓝光处理后，立即用甲醛固定后，提取细胞核供研究。如图9a所示，连续红光下生长的苗（图9A，R）或用蓝光照射后没有蛋白酶抑制剂（图9A和9B，模拟）的情况下幼苗中GFP-CRY2 没有形成核能小体。相反，在与蛋白酶体抑制剂存在的蓝光照射苗，GFP-CRY2 形成清晰可辨核小体（图9A和9B，MG115和MG132）。内源性CRY2观察到同样的现象。虽然CRY2核小体在野生型植株较难观察（如图8A），但当蛋白酶体抑制剂阻断蓝色诱导降解，更大，更容易分辨的内源性CRY2核小体能被检测到（图9c）。红光下生长的苗，没有检测到CRY2核小体的形成（图9b），证实了CRY2核小体的形成的蓝光特异性。综上所述，我们认为蓝光诱导CRY2的核小体的形成是与蓝色光致光感受器降解有关。讨论：我们当前对隐花色素光受体的光激发机制的认识自主要来自光受体突变的功能分析，包括错义突变的遗传学研究和光受体片段敲除的转基因表达的认识。例如，在观察隐花色素融合蛋白GUS-CCT1，GUS - CCT2，和GUS - NC80表现在转基因拟南芥构像活动的基础上，提出了隐花色素的光响应是通过一个开放的构象的改变激活其生理活动。在这项研究中，我们发现，一个全长隐花色素的生理生化活动也可以从完全依赖蓝光到部分不依赖蓝光转换。这个结果可以用先前研究的敲除光受体片段得出的开放构象假说解释。根据开放构象的解释，绿色荧光蛋白附着到一个隐花色素的C端可能会引起C端结构域从PHR的域部分脱离，结果导致在没有蓝光存在下的光受体的磷酸化作用和激活。观察发现，绿色荧光蛋白附着到隐花色素的N末端(GFP-CRY2的融合蛋白)不会引起类似光反应，表明CRY2-GFP的活性很可能是由于构象变化，而不是绿色荧光蛋白序列本身。目前仍然还不清楚CRY基因是如何在PHR域形成光受体同源蛋白的开放构象激活其生理活性进行光吸收。一个拟南芥隐花色素的PHR域的表达和纯化有着与DNA光修复酶相似的清晰可辨的结构，而从大肠杆菌表达和纯化的拟南芥隐花色素C端结构域在本质上是无序的。本质上无序的蛋白质或蛋白质结构域是在复杂的真核生物的信号蛋白质十分普遍。有人提出，这些内在无序的蛋白质可能发生所谓的诱导折叠或折叠耦合在有机体中发展为功能结构。可以猜测，对隐花色素C端结构域的折叠可能取决于结合PHR域或者它的互作蛋白，而在PHR域的光激发可能会改变这种耦合折叠引起光活化。除了GFP - CRY2和cry2 - GFP不同的生理生化活性，这两个融合蛋白还显示，核小体响应蓝光不同的活性。我们发现，CRY2-GFP形成了应答蓝光的核小体，而不是GFP-CRY2。CRY2- GFP的核小体不可能是一个实验产物因为内源性CRY2产生对蓝光响应的核小体，虽然他们不像CRY2-GFP那样容易被检测到。我们假设，不同CRY2蛋白在核体形成中表现的各种活性，是由于他们在蓝光下不同的稳定性。根据这一假说，对CRY2的降解的抑制作用促使GFP-CRY2 和内源性CRY2形成响应蓝光的核小体。这些结果显示了降解蓝光依赖性和形成蓝光依赖的CRY2核小体的密切相关。我们认为，光激发使CRY2积累或转移到核小体，在核小体被泛素化酶泛素化和26S蛋白酶体降解。CRY2核小体的相关蛋白质成分的鉴定可以直接检验这一假设。方法植物材料拟南芥突变体cry1 CRY2与cry1来自哥伦比亚品种。从质粒pEGAD扩增绿色荧光蛋白编码序列，通过5个氨基酸（GPPPG）连接到CRY2的C端，在载体pKYLX的XhoI和SacI 位点间插入，构建CRY2-GFP 的表达质粒。用同样的方法构建GFP-CRY2表达载体。这两种结构通过农杆菌介导法转入cry1 或cry1 cry2 突变体。对转基因株系进行了检测，通过免疫印迹分析选择了CRY2融合蛋白在类似水平表达的不依赖株系。光源和下胚轴伸长和开花时间的测量如前所述，除了LED红灯（660 nm的峰值;半衰期为20 nm带宽），而不是用荧光红灯。RNA和蛋白分析免疫印迹分析、免疫沉淀和体内磷酸化法如前所述。提取在黑暗中或蓝光下生长5 d的幼苗总蛋白，研磨后置于含有4* SDS-PAGE样品缓冲液的离心管。蛋白质在10的SDS - PAGE凝胶电泳中进行分离，并转移到硝酸纤维素膜做免疫印迹。用如前所述的免疫印迹法分析蓝光感应的CRY2降解。用RT - PCR对野生型CAB3和CHS基因，cry1 CRY2，GFP-CRY2/cry1 CRY2，CRY2-GFP/cry1 CRY2，以及cop1- 6突变体进行了mRNA的表达分析。种子消毒，然后在无蔗糖的MS培养基（Sigma - Aldrich公司）培养，分别放置在44天，接触白光4小时，和黑暗中6天。黄化幼苗立即冷冻在液氮中，和RT - PCR方法如前所述。荧光显微镜对于荧光显微镜分析，在MS 培养基中生长的幼苗，进行黑暗7 天或红光下14天处理，蓝光处理，并分析在甲醛固定幼苗或活幼苗胚轴的细胞核分离。对于固定核分析，幼苗被收集和固定在4甲醛20分钟，水洗10分钟两次，细胞核分离如前所述。对CRY2- GFP的核小体进行量化，手动测量从固定苗分离的细胞核焦平面的可辨别的核小体数量。每个图中至少存在120核小体的甲醛固定样品。对于药理研究，14天龄红光幼苗被50mM 的MG132或MG115（保存在DMSO）（EMD化学药品）处理8小时。GFP的荧光图像被拍在一次或连续两次每秒快照的固定频率。免疫染色分析如前所述。简单来说，从不同的光条件下处理幼苗分离出的细胞核中，分离出具有抗CRY2抗体（1 / 100稀释），洗三次（10mM磷酸钠盐，pH值7.0，和143mM氯化钠）。彻底洗净样品与羊抗兔IgG（1 / 200稀释）杂交用罗丹明红- X标记。荧光图像是用带有Zeiss Axiocam HRC彩色数字相机的Zeiss Axioskop 2 显微镜或带有Hamamatsu Orca-ER照相机的Zeiss AxioImager Z1 显微镜在3100放大倍率被拍的。图像分析采用 Zeiss AxioVision 软件和使用Adobe Photoshop（Adobe系统）处理。透射电镜透射电镜的条件是按前人描述的修改。幼苗生长在没有额外的材料或营养素的1/2MS完全黑暗下生长。定植五日后，幼苗分别用短的蓝色光脉冲处理（100秒; 104 mmol M22的），然后立即返回到黑暗24小时。黑暗收获六日黄化苗，直接进入pH值为6.9的0.05 M卡可酸钠缓冲液。样品在室温下旋转2小时，然后在黑暗中轻轻旋转4条过夜。组织用 pH值为6.9的0.05 M的卡可酸钠缓冲液洗三次，每次10分钟。然后子叶二次固定在0.05 M的卡可酸钠缓冲液的2锇酸中，pH值6.9，在室温下2小时。子叶上述缓冲液清洗，对齐，然后在4下固定在SeaPrep超低温琼脂糖凝胶中（FMC），接着由10，25，50，65，75和95系列梯度乙醇顺序脱水，每次15分钟。在三个变化的分子筛上用100的乙醇继续脱水，每次持续15分钟。脱水样品浸润在斯珀尔的低粘度树脂（EMS），使用比率如下：2分100的乙醇比1分斯珀尔的树脂（24小时），1份100的乙醇比1份斯珀尔的树脂（24小时）， 1份100的乙醇比2份斯珀尔树脂（24小时）。浸润是在纯斯珀尔的树脂三变化下完成（渗透超过24小时），在室温下的转子下操作。在浸润样品放置在平面嵌入模具，在烘箱里78下聚合3天。聚合块用刀片切片，切片厚度（0.5毫米），染色，光显微镜下观察。一旦发现感兴趣的区域，薄切片样品用80至90纳米的超薄切片机（钻石刀）进行超薄切片。薄切片，放在火棉胶片 /碳涂层200目六角镍网，用溶于50的乙醇的5醋酸铀染色。网格是用蒸馏水漂洗，晾干，并与雷诺的柠檬酸铅（EMS）的染色，然后洗净，晒干如上。干染色电网被放置在一个日本电子1200EX透射电子显微镜下，感兴趣的细胞，在60千伏下使用柯达4489电子显微镜片拍摄。然后把胶片图像数字格式化。计算机建模CRY2的PHR域的辅助表面拓扑结构模型与CRY1的不一致。对于CRY2计算模型，假设原子坐标CRY2的PHR的域（残基1至490）使用服务器上的ExPASy（http:/swissmodel.expasy.org）瑞士型的同源建模程序生成。CRY2 PHR 的假设结构是用pymol的分子可视化程序（）制作的，表面采用泊松-波尔兹曼Solver软件计算静电势（）。带负电荷表面染成红色，带正电的区域是蓝色。该CRY2的辅助的C -端区域是随意画成一个弯曲的黑线。 GFP作为一个GFP的晶体结构的图像代表。登录号这篇文章序列数据在拟南芥基因组计划或GenBank中/ EMBL的数据库可以查阅，以下是登录号：CRY1，At1g04400； CRY2，At4g08920；CHS，At5g13930和CAB3，At1g29910。补充数据下面的材料可在本文的在线版本查阅补充图1：一个代表的免疫印迹显示野生型CRY2或cry1 cry2 突变体背景中融合蛋白GFP-CRY2和CRY2-GFP 的表达水平。补充图2：一种指示基因型下胚轴生长的注量速率响应。补充图3：以cry1突变体为背景的表达CRY2-GFP 的转基因植物，组成型光形态表型。补充图4：以cry1突变体为背景的表达CRY2-GFP 的转基因植物的开花时间补充图5：显示内源CRY2核小体和CRY2- GR的融合蛋白核小体的免疫染色。补充图6：补充电影的指示帧的静止图