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细菌总数检测作业指导书细菌总数检测作业指导书1.1.试剂和培养基配制试剂和培养基配制1.1 试剂配制1.1.1 氢氧化钠溶液（160g/l）：称取氢氧化钠160g，溶于 1000ml 的蒸馏水中。1.1.2 吐温溶液：取 1ml 吐温 80，溶于 2000ml 蒸馏水中。1.2 培养基配制1.2.1 2216E 培养基的成分：蛋白胨 5g；酵母膏1g；磷酸高铁 0.1g；琼脂 20g；陈海水 1000ml。1.2.2 制备：将上述成分加热溶解，用氢氧化钠溶液调节 PH 为 7.6。分装于锥形瓶中，置高压蒸汽灭菌器中，在 121下灭菌 20min，而后，将此培养基分别倒入经灭菌的各平皿中，每平皿约 15ml，待其冷却凝固，置冰箱内保存备用。2.2.样品采集样品采集2.1 样品瓶应用可耐灭菌处理的广口玻璃瓶或无毒的塑料瓶。灭菌前，把具有玻璃瓶塞得采样瓶用铝箔或厚的牛皮纸包裹，瓶颈系一长绳，在 121经 15min 高压灭菌。2.2 水样采集开瓶塞时，要连同铝箔一起拿开。手执长绳的末端，将采样瓶投入选定点的海水内，采集水下约 10cm 处水样。采好的水样需盖紧瓶塞，编号瓶号，按表所列项目记录。水样在瓶内要留下足够的空间以备在检验前摇荡混匀。该法适用于沿岸水域的采集。2.3 泥样采集用小型底栖生物 柱状采泥器或弹簧采泥器采集泥阳，采泥器出水后，在预先选定的泥层中用无菌刮板取一定量的样品置于灭菌容器中。2.4 样品保存和储藏采集的水样和泥样应立即送检，时间不超过 2h，否则，应将样品置于冰瓶或冰箱中，但不得超过 24h，否则影响检验结果。3.3.测定步骤测定步骤3.1 依水样量，按 100ml 水样加 1ml 吐温溶液，充分摇匀，使样品中的细菌细胞分散成单一细胞。3.2 以无菌操作法吸取 1ml 水样注入盛有 9ml 灭菌陈海水的试管内混匀，并依同法一次连续稀释至所需要的稀释度。稀释度依水样含菌量而定，以每平皿的菌落数在30300 个之间为宜，每种稀释度需有 3 个平行样。3.3 取 0.1ml 稀释水样，滴入制好的平皿上，用灭菌玻璃刮棒将菌液涂抹均匀，平放于超净工作台上2030min，使菌液渗入培养基。3.4 将此平皿置于 25恒温箱内培养 7d，取出计数菌落。3.5 菌落计数法：a)当平皿上出现较大片菌苔时，则不应计数。b)选择菌落数在 30300 个之间的平皿，以平均菌落数乘其稀释倍数，即为该水样的细菌数。c)若有两种稀释度的平均菌落数均在 30300 个之间，则应按两者菌落数之比值决定，比值小于 2，取两者的平均数，若大于 2，取其较小的菌落数。d)若所有稀释度中各不同稀释度的平均菌落数均大于300，则以稀释度最高的平均菌落数乘其稀释倍数。e)若所有稀释度中各不同稀释度的平均菌落数均小于30，则用稀释度最低的平均菌落数乘其稀释倍数。f)若所有稀释度都没有长出菌落，同时也没检出抑制物，则报告小于 1 乘其最低稀释倍数。