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致突变试验 致突变试验2.3.8.1 L5178Y 细胞基因突变试验2.3.8.1.1 目的检测消毒剂对体外培养的哺乳动物细胞的基因突变作用，以作为评价消毒剂致突变性的依据。2.3.8.1.2 试剂 （1）F10P培养液: 为完全培养液。以Fischer或 RPMI1640培养液，加入马血清10%，丙酮酸钠 220g/ml，青霉素100IU/ml和链霉素 100g/ml 配制而成(pH为7.27.4)。 于4 冰箱中保存备用。（2）F0P培养液:为无血清培养液。以 Fischer或 RPMI1640培养液，加入丙酮酸钠220g/ml，青霉素 100 IU/ml和链霉素100g/ml等配制而成(pH 为7.27.4)。于4冰箱中保存备用。（3)马血清:将过滤除菌后的马血清，经56作用 30min灭活补体。分装后，于-20保存备用。（4)集落用培养基:用Fischer 或RPMI1640培养液，加入马血清 20%、丙酮酸钠 220g/ml、琼脂0.37%配制而成。（5）无钙镁磷酸盐缓冲液(无钙镁PBS，pH 为7.27.4): 磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.20g磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O) 2.89g氯化钾(KCl) 0.20g氯化钠(NaCl) 8.00g双蒸水(压力蒸汽灭菌) 1000ml（6)受试物:最好能直接溶于F10P与F0P培养液中。否则需先溶于二甲基亚砜(DMSO)，而后再加于上述培养液内。所加 DMSO的量应低于 1%(V/V)。（7)阳性对照物:选用甲基磺酸乙酯(EMS)，丝裂霉素C(MMC)，甲基硝基亚硝基胍 (MNNG)，苯并(a)芘 (BaP) 等。（8）三氟胸苷(TFT):用生理盐水配成100g/ml 溶液，可冻存3 个月。（9）肝微粒体酶混合液(S9 混合液):取健康的雄性成年SD 或Wistar大鼠，体重 150g 左右，约5周龄6 周龄。将多氯联苯(Aroclor 1254)，溶于玉米油中，浓度200mg/ml，按 500mg/kg体重一次腹腔注射。5d后，断头处死动物，取出肝脏称重后，用预冷的0.15mol/L 氯化钾溶液冲洗肝脏数次。 每克肝(湿重)加 0.15mol/L氯化钾溶液3ml。剪碎肝脏，在冰浴中用玻璃匀浆器制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。将肝匀浆用低温(04)高速离心机，以 9000g离心 10min。取上清液即为S9，分装于无菌冷冻安瓿中。S9 制成后，需进行无菌检查，以及用间接致癌物鉴定其活性。合格者置-80或液氮中储存备用，储存期不超过1 年。S9混合液应以上述 S9 液在临用时按无菌要求配制。 一般配成含10% S9的混合液。其配方如下：S9 0.10ml1.65mo1/L氯化钾 + 0.4 mol/L 氯化镁 0.04ml葡萄糖-6-磷酸.2Na 1.8mg氧化型辅酶 II (NADP) 3.1mg用F0P培养液补足至 1.0ml2.3.8.1.3 细胞试验以小鼠淋巴瘤L5178Y 细胞胸苷激酶(TK) 座位为杂合子 (tk+/tk-) 检测 TK 基因的突变。为减少细胞的自发突变率，在制备该细胞试验用悬液时，先将其在加有 THMG 的 F10P 培养液中培养24h，杀灭培养液中所存在的自发突变细胞 (tk-/tk-)，然后将细胞悬浮于THG 培养液(不含氨甲喋呤的 THMG 培养液)中培养 1d3d。THMG 含下列4 种成分，各成分的终末浓度如下:胸苷 5×10-6 mol/L次黄嘌呤 5×10-5 mol/L氨甲喋呤 4×10-7 mol/L甘氨酸 1×10-4 mol/L2.3.8.1.4 试验分组一般设4 个剂量组。 对有细胞毒性的受试物，最高剂量组的细胞存活率为10%20%，无细胞毒性受试物最高剂量不超过 10mmol/L或5mg/ml。 同时应有阴性（溶剂）对照组、 未处理对照组和阳性对照组。除未处理对照组外，试验组和其它对照组，还均应包括有加S9 混合液和不加S9 混合液两大部分。2.3.8.1.5 操作程序（1）细胞准备:将新清除了自发突变体的细胞群体，用F10P培养液制成悬液。以无菌烧瓶加入细胞悬液和F10P 培养液至100 ml，细胞终末密度为7×103个/ml8×103 个/ml。培养物以含5%二氧化碳的空气充气后，加盖密闭，于37进行培养。L5178Y 细胞的细胞殖周期约为10h11h，在常规培养 24h后，细胞数将增加约5 倍。 用稀释法维持生长，每天将细胞培养物用F10P 培养液作4 倍稀释(或隔天用 F10P培养液作 24 倍稀释)，继续培养。实验前一天用 F10P培养液和 F0P 培养液各 50% 的对半混合液(马血清终末浓度为 5%) 稀释。（2)受试物处理:用上述F10P和F0P 的对半混合液将细胞培养物稀释至 1×106 个/ml，并分种于50ml有盖试管中，每管 6ml，再加S9 混合液 4ml(总量共 10ml)。 不加 S9 混合液管，代之以F0P培养液。在上述试管内加入一定浓度的受试物，并以含5%二氧化碳的空气充气后加盖密闭，于37培养 4h。处理结束后，以200g 离心 10min，除去含受试物的上清液，收集细胞。 细胞用Hanks液洗涤，再加入 20mlF10P培养液充分混悬(细胞浓度为 0.3×l06 个/ml)，以含 5%二氧化碳的空气充气后，加盖密闭，于37 振荡培养，开始表达。（3）表达:细胞的表现型表达时间为2d。表达开始后 24和48h经计数后将细胞稀释至3 ×105 个/ml。（4）选择和集落化:表达结束后，取10ml 培养物经离心后除去大部分上清液。 并将细胞在留下的约1mlF10P培养基中混悬。 将细胞悬液移入含100ml 集落培养基的烧瓶中。此时细胞密度为 3×l04个/ml。 在 37振荡培养 30min。 取出 0.5ml 后，向余下的细胞悬液中加入 1.0ml TFT 贮存液，继续振荡培养15min。将样本取出，倒于 3 个 10cm 平皿中，每平皿33ml，含 1×l06个细胞(称为 TFT 平板)，作突变体的选择。将先前取出的0.5ml 细胞悬液用集落培养基先作 1:100 稀释，细胞悬液浓度为3×l02 个/ml。 振荡培养15min 后，取出 2.0ml 再用集落培养基作 1:50 稀释(此时细胞悬液浓度为 6个/ml) 后振荡培养。经 15min培养后，倒入 3个直径为100mm 的平皿中，每平皿33ml，含细胞 200个(称为VC 平板)。待琼脂凝固后，置二氧化碳培养箱(37)中静置培养 10d。 计数各个平皿中出现的集落数，计算集落形成效率(CFE)。（5)阳性与阴性对照组的操作程序同试验组，仅阳性对照组用阳性对照物代替受试物，阴性(溶剂)对照组用受试物溶剂代替受试物。 另设一未处理对照组。（6) 按下列公式计算有关指标:绝对 CFE = (形成集落数 / 接种细胞数) 相对 CFE = (试验组绝对CFE / 溶剂对照组绝对 CFE) × 100%突变频率 (MF) = (TFT平皿集落数 / VC 平皿集落数) × 稀释系数（在此，稀释系数为 2×l0-4）。2.3.8.1.6 评价规定（1）对 L5178Y 细胞，推荐可接受的自发突变频率范围为 20/106100/106个存活细胞。（2）用适当的显著性检验方法进行统计学处理，当各剂量组 MF 与阴性(溶剂)对照组者相比突变率，有显著性意义的增加，并呈剂量-反应关系时，或仅一个剂量组有统计学意义的增加并经重复试验证实者，均可判为阳性结果，即受试物对L5178Y 细胞 TK 系统有致突变性。2.3.8.2 V79 细胞基因突变试验2.3.8.2.1 目的检测消毒剂对体外培养的哺乳动物细胞可否引起基因突变，以对消毒剂的致突变性做出评价。2.3.8.2.2 试剂 （1）完全培养液：以Eagle 最低必需培养液(EMEM)或RPMI1640培养液加10%小牛血清、青霉素 (100IU/ml) 和链霉素 (100g/ml) 配制而成。（2)小牛血清:将过滤除菌后的小牛血清放入56水浴中，保温 30min 以灭活补体，而后分装，保存于-20备用。（3）无钙镁磷酸盐缓冲液(无钙镁PBS):见 2.3.8.1.2 （5）。 （4)胰蛋白酶-EDTA溶液:分别用无钙镁 PBS 配制胰蛋白酶与 EDTA 溶液，胰蛋白酶溶液浓度为0.05%，EDTA 溶液浓度为0.02%。两溶液按 1:1混合。存放于-20 备用。（5)受试物: 最好能直接溶于无血清培养液内。 否则，需先溶于二甲基亚砜(DMSO)，而后加于无血清培养液内。所加DMSO 溶液量为0.5%(V/V)。（6)阳性对照物:可根据受试物的性质和结构选用不同的阳性对照物，例如甲基磺酸乙酯(EMS)，丝裂霉素C(MMC)，甲基硝基亚硝基胍(MNNG)，苯并()芘(BaP)等。（7)6-硫代鸟嘌呤(6-TG): 用0.5% 碳酸氢钠溶液配制为1.0mg/mL 溶液，保存于4备用。（8）肝微粒体酶混合液(S9混合液):见 2.3.8.1.2 （9）。（9）姬姆萨染液: 取姬姆萨染料3.8g，置玛瑙乳钵中，加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至375ml，待完全溶解后，再加 125ml甘油，放入 37温箱中保温 48h。保温期间振摇数次，使充分溶解。取出过滤，2 周后使用，作为姬姆萨染液原液。使用时，取1 份姬姆萨染液原液，与9份 1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8) 混合，配成其应用液。磷酸盐缓冲液(1/15mol/L，pH6.8)配制方法如下:第一液:取磷酸氢二钠9.47g 溶于蒸馏水1000ml中，配成1/15mol/L溶液。第二液:取磷酸二氢钾49.07g 溶于蒸馏水1000ml中，配成1/15mol/L溶液。取第一液49.5ml 加于第二液50.5ml中混匀，即为 pH6.8的1/15mol/LPBS。2.3.8.2.3 细胞以中国仓鼠肺(V79) 细胞株进行试验。 为减少其自发突变，正式试验前将野生型细胞接种于含THMG(见 2.3.8.1.3)的MEM培养液内并在二氧化碳培养箱中培养一周，以杀灭自发 HGPRT位点突变体。遂后重新接种于MEM 培养液中。2.3.8.2.4 试验分组一般设4 个试验剂量组。 对有细胞毒性的受试物，最高剂量组的细胞存活率为10%20%，无细胞毒性受试物最高剂量不超过10mmol/L(或5mg/ml)。 同时，应设阴性（溶剂）对照组、 未处理对照组和阳性对照组。除未处理对照组外，各组均应包括加S9 混合液和不加该液的样本。2.3.8.2.5 操作程序 （1）细胞准备:将5×105 个细胞接种于含完全培养液的直径为100mm 的平皿中，除未处理对照组外，每组 2皿共13 皿。 于二氧化碳培养箱中(37)培养24h。(2)接触受试物：吸去上述供试培养皿中的培养液，用无钙镁 PBS 洗2 次。 将含有细胞的培养皿分为二大组，一组加 S9混合液，另一组不加S9 混合液。 加 S9 混合液组，在培养皿中加入 2mlS9混合液，对不加S9 混合液组，则用 2ml 无血清培养液代替，再加一定量不同浓度受试物的供试液，最后用不含血清的培养液补足至10ml。并将培养皿置CO2培养箱中培养5h，处理结束后，吸去培养皿中液体部分，用无钙镁 PBS洗涤细胞 2次，再加入完全培养液10ml，在 CO2培养箱中培养19h22h。 阳性和阴性(溶剂)对照组也分加与不加 S9混合液两大组，操作方法同上。(3)表达：将培养物用胰蛋白酶-EDTA 消化。待细胞脱落后，加入完全培养液，终止消 化。混匀、计数并进行表达和细胞毒性测定见 2.3.8.2.5（4)。表达时，以 5×105 个细胞接种于直径为100mm 的平皿中。 培养3 天后，分传一次，仍接种5×105 个细胞，培养 3天后再进行突变体的选择及集落形成效率(CFE)的测定。(4)细胞毒性测定:将上述消化计数后的细胞，每平皿接种200个，每组5 个平皿，于二氧化碳培养箱内(37)培养7d。 取出样本，固定并进行姬姆萨染色后，计数各平皿的细胞集落数。 以相对 CFE值表示细胞的毒性。(5)突变体的选择及集落形成率的测定: 表达结束后，消化细胞，分别接种，每组5 个平皿，每平皿种 2×105个细胞。待细胞贴壁后加入 6-TG，终末浓度为 5g/ml。放入二氧化碳培养箱培养7d10d。固定后进行姬姆萨染色，计数平皿内集落数，并计算其突变频率(MF)。(6)阳性与阴性对照组的操作程序同试验组，仅阳性对照组用阳性对照物代替受试物，阴性(溶剂)对照组用受试物溶剂代替受试物。另设一阴性(未处理)对照组。 (7)按下列公式计算有关指标:绝对 CFE = (形成集落数/接种细胞数) 相对 CFE = (试验组绝对CFE/溶剂对照组绝对 CFE) × 100%突变频率 (MF) = (突变集落数/接种细胞数) ×（1/绝对CFE）2.3.8.2.6 评价规定(1)对V79 细胞，推荐可接受的自发突变频率范围为 10/106100/106个存活细胞。(2)用适当的显著性检验方法进行统计学处理，当各剂量组MF与阴性(溶剂)对照组者相比，突变率有显著性意义的增加，并呈剂量-反应关系时，或仅一个剂量组有统计学意义的增加并经重复试验证实者，均可判为阳性结果，即受试物对 V79 细胞 HGPRT 系统有致突变性。2.3.8.3 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验2.3.8.3.1 目的用细胞遗传学方法检测体外培养的哺乳动物细胞染色体畸变，评价消毒剂的致突变性。2.3.8.3.2 试剂(1)完全培养液: 采用 Eagle最低必需培养液(EMEM)或Dulbecco 最低必需培养液 (DMEM)等，并加入 10%小牛血清以及青霉素(100IU/ml) 和链霉素(100g/ml)。(2)小牛血清:将过滤除菌后的小牛血清，放人56恒温水浴中，保温 30min 灭活补体。处理后分装，保存于-20备用。(3)无钙镁磷酸缓冲液无钙镁PBS，pH 为7.27.4。见2.3.8.1.2（5)。(4)胰蛋白酶-EDTA:见2.3.8.2.2（4）。(5)受试物: 最好能直接溶于无血清完全培养液内。否则，需先溶于二甲基亚砜(DMSO)，而后加于完全培养液内。所加DMSO 溶液量应低于1.0%(V/V)。(6)阳性对照物：加S9 时选用环磷酰胺等，不加S9时选用丝裂霉素 C等。(7)肝微粒体酶混合液(S9 混合液):见2.3.8.1.2（9)。 (8)秋水仙素溶液(0.04%)：取40mg 秋水仙素溶解于100ml无菌0.85%氯化钠溶液中，过滤除菌。(9)氯化钾溶液(0.075mol/L)。(10)甲醇/冰醋酸(3:1，V/V) 固定液: 临用现配。(11)姬姆萨染液: 见2.3.8.2.2（9)。2.3.8.3.3 细胞可选用中国仓鼠肺（CHL）细胞、中国仓鼠肺 （V79） 细胞、中国仓鼠卵巢 （CHO） 细胞，或人外周血淋巴细胞等进行试验。在一般情况下，本试验推荐使用CHL 细胞。 使用CHL 细胞时，在试验前一天，将其1×l06 个细胞接种于直径为100mm 平皿中，置37二氧化碳培养箱内待用。2.3.8.3.4 试验分组所设试验剂量组应不少于4 个。最高剂量组的细胞存活率应为10%20%，无毒性受试 物最高剂量组不超过10mmol/L(或5mg/ml)。 同时，应设阴性(溶剂)对照组、 未处理对照组和阳性对照组。除未处理对照组外，各组均应包括加S9 混合液和不加该液的样本。2.3.8.3.5 操作程序(1) 试验时，吸出细胞培养平皿中的培养液，加入试验所规定浓度的受试物和S9 混合物(10%) 以及不含小牛血清的完全培养液，放二氧化碳培养箱内作用2h。 结束后，吸去完全培养液，用 Hanks液洗细胞3 次。加完全培养液，再置二氧化碳培养箱中培养，于 24h收获细胞。收获细胞之前2h4h，加入秋水仙素溶液(终末浓度为1g/ml)，阻断细胞于有丝分裂中期相。(2)收获细胞时，用胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，待细胞脱落，加入培养液并混匀 以终止胰蛋白酶作用。 离心(1000r/min1200r/min，5min7min)，弃去上清液后，加入0.075mol/L 氯化钾溶液低渗处理10min20min。 离心后，再以甲醇/冰醋酸液固定 2次。按常规滴片干燥，用姬姆萨应用液染色15min 左右。(3)阳性与阴性对照组的操作程序同试验组，只是阳性对照组用已知染色体断裂剂替代受试物。阴性(溶剂)对照组用受试物的溶剂。另设一未处理对照组。(4)观察：每组各选100 个染色体分散良好的中期分裂相细胞，进行染色体畸变分析，观察和记录染色体结构的异常及数量异常。染色体结构异常可有：断裂，微小体，有着丝点环，无着丝点环，单体互换，双微小体，裂隙，非特定性型变化(粉碎化等)。 染色体数量异常可有:非整倍体，多倍体，内复制。2.3.8.3.6 评价规定用2 检验或其他适当的显著性检验方法，对所得试验数据进行统计学处理。 当各剂量组与阴性(溶剂)对照组相比，畸变细胞率的增加有显著性意义，并有剂量-反应关系时； 或仅一个剂量组有显著性意义的增加，并经重复试验证实时，可判为该受试物在本试验中具有致突变性。2.3.8.4 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验2.3.8.4.1 目的检测消毒剂对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成的影响，评价消毒剂的染色体损伤毒性。2.3.8.4.2 试剂(1)受试物: 用水、植物油或用0.5%羧甲基纤维素钠配制成溶液或混悬液。(2)阳性对照物: 常用环磷酰胺或丝裂霉素C。(3)小牛血清:见2.3.8.3.2（2）。(4)姬姆萨染液:见2.3.8.2.2（9）。2.3.8.4.3 实验动物选用体重为25g30g 的小鼠，雌雄各半，随机分组。2.3.8.4.4 试验分组受试物至少设3 个剂量组，每个剂量组用10只动物，雌雄各半。另设阴性(溶剂)和阳性对照组。剂量组一般取受试物的1/2LD50、 1/5LD50、 1/20LD50等剂量，以得到剂量-反应关系。 高剂量组应不引起动物死亡，不引起明显骨髓抑制。 若采用一次最大限度试验测得 LD50大于 5000mg/kg体重，即以 5000mg/kg体重为高剂量。2.3.8.4.5 操作程序(1)动物染毒采用经口灌胃30h 染毒法，即两次染毒间隔 24h，第二次染毒后6h 取材。(2)用颈椎脱臼法处死动物，取股骨或胸骨。剥除肌肉，擦净血污。切断股骨或胸骨两端，暴露骨髓腔。(3)用注射器吸取0.1ml 小牛血清，冲洗骨髓腔。用冲洗液常规涂片，晾干或热风吹干。(4)将已干的涂片，在甲醇中固定5min10min。用姬姆萨应用液染色10min15min，然后用 pH6.8PBS 液冲洗，晾干。(5)阳性与阴性对照组的操作程序同试验组。阳性组选用环磷酰胺(40 mg/kg体重)或丝裂霉素(1mg/kg1.5mg/kg 体重)。阴性(溶剂)对照组用受试物溶剂。(6)选择细胞分布均匀、 完整、 着色适当的区域。 在油镜下计数含微核的嗜多染红细胞（PCE）数。PCE呈灰蓝色成熟红细胞(NCE)呈粉红色，微核多呈圆形、 边缘光滑、 整齐，嗜色性与有核细胞核质一致，呈紫红色或蓝紫色。直径通常为红细胞的1/201/5。(7)每只动物计数1000 个PCE。微核细胞率指含有微核的PCE 数，以千分率表示。 1 个 PCE中出现有 2个或多个微核，仍按1 个计数。 此外，还应观察PCE/NCE 比例，作为对细胞毒性的指标。 一般计数200个 PCE，同时记数所见到的 NCE。当PCE/NCE小于 0.1时，提示对骨髓具有明显抑制作用，应降低受试物剂量，重新进行试验。2.3.8.4.6 评价规定阴性对照组小鼠，微核细胞率一般不超过0.3%。用波松分布 u 检验或其他适当的显著性试验方法，进行统计学处理。 当各剂量组与溶剂对照组相比，微核细胞率的增加有显著性意义，并有剂量-反应关系，或仅一个剂量组微核细胞率增加有显著性意义，并经重复试验证实时，均可判为受试物具有体内染色体损伤作用。2.3.8.5 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验2.3.8.5.1 目的用细胞遗传学方法检测实验动物骨髓细胞染色体畸变率，以评价消毒剂的致突变性。2.3.8.5.2 试剂(1)阳性对照物: 常用环磷酰胺，丝裂霉素C 等。(2)秋水仙素(0.04%):取40mg 秋水仙素溶解于100ml无菌的0.85% 氯化钠溶液中，过滤除菌。(3)氯化钾溶液(0.075mol/L)。(4)甲醇/冰醋酸(3:1，V/V)固定液:临用现配。(5)姬姆萨染液见2.3.8.2.2（9)。(6)磷酸盐缓冲液(PBS，1/15mol/L，pH7.4)。2.3.8.5.3 实验动物成年小鼠(体重25g30g)，或大鼠(体重 180g220g)。动物总数不少于30 只，雌雄各半。2.3.8.5.4 试验分组随机分为5 组。至少 3 个受试物剂量组，为1/2LD50、 1/5LD50、 1/20LD50。 若采用一次最大限度试验，测得 LD50大于5000mg/kg体重，即以 5000mg/kg体重为高剂量。另设阳性对照组和阴性(溶剂)对照组，每组6 只动物，雌雄各半。 阳性对照组可用环磷酰胺(40mg/kg体重) 或丝裂霉素 C(1.5mg/kg2mg/kg体重)。阴性(溶剂)对照组采用受试物溶剂。2.3.8.5.5 操作程序(1)用经口灌胃方式，共染毒两次，间隔24h。于第二次染毒后6h 处死动物。处死动物前 2h4h腹腔注射0.04%秋水仙素溶液，剂量为 4mg/kg 体重。(2)用颈椎脱臼法处死动物，取出股骨，剔除肌肉等组织。(3)剪去股骨两端，用注射器吸取5ml 生理盐水，从股骨一端注入，用10ml 离心管从股骨另一端接取流出的骨髓细胞悬液。(4)将骨髓细胞悬液离心(1000r/min，5min7min)，除上清液。加 0.075mol/L 氯化钾溶液 7m1，用滴管将细胞轻轻混匀，置37水浴中低渗处理7min。(5)加入2ml 甲醇/冰醋酸固定液，混匀。 离心(1000r/min，5min7min)，弃上清液。再加入7ml 固定液，混匀，固定7min。离心(1000r/min，7min)，弃去上清液。(6)用同法再固定1 次2次，弃上清液，加入数滴新鲜固定液，混匀。(7)用悬液滴片，晾干，以姬姆萨应用液染色。(8)每组各选100 个染色体分散良好的中期分裂相细胞，进行染色体畸变分析，观察和记录染色体结构的异常和数量的异常。 染色体结构异常可有:断裂、 微小体、 有着丝点环、 单体互换、 双微小体、 裂隙、粉碎化等。染色体数量的异常可有:非整倍体、多倍体、内复制等。(9)计算畸变细胞率。畸变细胞率为100 个中期分裂相细胞中有染色体畸变的细胞数。 一个中期分裂相细胞出现两种或多种畸变，仍按一个有染色体畸变细胞计。(10)阳性与阴性(溶液)对照组的操作程序同试验组。 只是阳性组选用环磷酰胺(40mg/kg 体重)或丝裂霉素(1.5mg/kg2.0mg/kg体重)作为受试物的替代物。阴性(溶剂)对照组用受试物溶剂作为受试物的替代物。2.3.8.5.6 评价规定用2 检验或其他适当的显著性检验方法对所得试验数据进行统计学处理。 当各剂量组与阴性(溶剂)对照组相比，畸变细胞率的增加有显著性意义，并有剂量-反应关系时；或仅一个剂量组畸变细胞率增加有显著性意义，并经重复试验证实时，可判为该受试物在本试验中具有致突变性。2.3.8.6 程序外DNA 修复合成试验2.3.8.6.1 目的检测受试物是否可引起体外哺乳动物细胞的原发 DNA 损伤。推荐用放射自显影法进行测定。2.3.8.6.2 试剂(1)完全培养液:用Eagle 最低要求培养基(EMEM)85份加小牛血清 15 份，青霉素 (终末浓度 100IU/ml)与链霉素(终末浓度100g/mL)，pH为 7.27.4。过滤除菌后，保存于4冰箱备用。(2）同步培养液:用不含精氨酸的EMEM 培养基 98 份，加小牛血清 2 份，再加青霉素(终末浓度100IU/ml)与链霉素(终末浓度为100g/mL)配制而成。(3）小牛血清:见3.11.2.2 2)。(4）无钙镁磷酸盐缓冲液(无钙镁PBS):见 2.3.8.1.2（5）。(5）胰蛋白酶-EDTA溶液:见 2.3.8.2.2（4）。(6）甲醇/冰醋酸(3:1，V/V) 固定液:临用现配。(7）羟基脲(HU)贮备液:250mmol/L。(8）1% 枸橼酸钠溶液。(9）3H-胸腺嘧啶核苷(10）NTB-2 核乳胶或国产核-4乳胶。(11）肝微粒体酶混合液(S-9混合液):见 2.3.8.1.2（9）。(12)显影液及定影液:包括柯达(Kodak)D-196显影液、停显液及F-5 定影液。2.3.8.6.3 细胞可选用人成纤维细胞、大鼠原代肝细胞、外周血淋巴细胞等进行试验。本规范推荐使用人胚肺成纤维细胞(2BS)。2.3.8.6.4 试验分组受试物可设4 个剂量组。 最高剂量组应使细胞存活率在10%20%之间。无毒性受试物最高剂量不超过 10mmol/ml。同时应有阴性 (未处理、溶剂) 对照组和阳性对照组。2.3.8.6.5 操作程序人胚肺成纤维细胞(2BS)放射自显影法操作程序。(1)将细胞增殖至所需数量后，用完全培养液制成单细胞悬液，浓度为0.5×105个/ml1.0× 105个/ml。将细胞悬液接种置有小盖玻片的6 孔细胞培养板中，在37二氧化碳培养箱内培养1d3d，至细胞50% 融合。每一剂量组和各对照组分别作2 个3个平行样本。(2)换用同步培养液，培养 3d。(3)在试验的前一日下午，加入羟基脲(HU)贮备液使HU 的终末浓度为10mmol/L。 继续在 37下培养16h，然后将上述长有细胞之盖片置于含有不同浓度的受试物、 HU(10mmol/L) 及3H - 胸腺嘧啶核苷(5Ci/ml10Ci/ml，30Ci/mmol)同步培养液中。 在37培养 5h。(4)阳性及阴性对照组的操作程序同试验组，只是阳性对照组用阳性对照物代替受试物，阴性(溶剂)对照组用受试物溶剂代替受试物。(5)处理结束后，用Hanks 液洗涤3次，再用 1%枸掾酸钠溶液处理 10min。 将小盖玻片用甲醇-冰醋酸固定液固定 30min，重复2 次。干燥过夜，将有细胞的盖玻片用少量中性树胶，粘固于载玻片上，长有细胞的一面朝上。(6)在暗室中，将适量之NTB-2 乳胶(或核-4乳胶)移入浸渍用之玻璃器皿中，置40水浴中融化，再加入等量 40蒸馏水，继续在水浴中加温，用玻璃棒轻轻搅拌10min20 min，使气泡逸出。同时将准备做自显影处理的载玻片，置水浴箱平台上预热。 而后，将附有样本的载玻片垂直浸渍于乳胶液中约5s。提出玻片，拭去其背面乳胶并待其干固。(7)将干固的附有样本的载玻片置于有变色硅胶干燥剂袋的曝光盒中，盒外包黑色避光 纸，于4冰箱中曝光 10d。 曝光后，将玻片在 D-19 显影液中显影 4min，在停显液中漂洗30s，在 F-5定影液中定影 10min，再用水漂洗数小时。(8)细胞在显影后用姬姆萨染液染色，脱水透明后，用盖片封固。在油镜下，计数各样本细胞核的显影银粒数，每个样本计数100 个细胞，同时计数相当面积的本底银粒数，两者之差为细胞核净银粒数。计算各试验组和对照组“银粒数/核“的均值及其标准差。2.3.8.6.6 评价规定用t 检验或其他适当的显著性检验方法进行统计学处理。 当各试验剂量组“银粒数/核“ 均值与阴性(溶剂)对照组者相比，有显著性意义的增加，并呈剂量-反应关系时；或仅一个剂量组有统计学意义的增加，但经重复试验证实者，可判为该受试物诱导了DNA 修复合成，具有DNA 损伤作用。2.3.8.7 小鼠精子畸形试验2.3.8.7.1 目的以哺乳动物体内试验，检测受试物对雄性生殖细胞的遗传毒性(精子形态异常)。2.3.8.7.2 试剂(1)受试物: 常用水、植物油，或用0.5%羧甲基纤维素钠配制成混悬液。(2)阳性对照物:常用环磷酰胺或丝裂霉素C。(3)甲醇（优级纯）。(4)2.5%伊红溶液:称取伊红2.5g，溶于 100 ml 蒸馏水中备用。2.3.8.7.3 实验动物成年雄性小鼠至少25 只，体重25g35g。2.3.8.7.4 试验分组设3 个试验剂量组，最高剂量可取最大耐受量，或分别取1/2LD50、 1/5LD50、 1/20LD50。 若采用一次最大限量试验，测得 LD50大于5000mg/kg体重，即以 5000mg/kg体重为高剂量。另设阳性对照组和阴性(溶剂)对照组。每组 5 只动物。2.3.8.7.5 操作程序(1)小鼠灌胃染毒。连续 5d，每天 1 次。(2)首次染毒后 35d，用颈椎脱臼法处死动物，剖腹，取出附睾。(3)将附睾放入盛有2ml 生理盐水的平皿中，用眼科剪剪碎。 以 3层擦镜纸过滤，取滤液离心(1000r/min，5min)。(4)除上清液。 加入少量生理盐水，以混悬液涂片。 自然干燥。 甲醇固定5min，用伊红溶液染色 1h。(5)在高倍显微镜下，每只动物计数1000 个精子中的畸形精子数。 精子畸形类型可分为无钩、 香蕉形、 胖头、 无定形、 尾折叠、 双头、 双尾等。 分别记录其畸变类型，以统计精子畸形率及精子畸形类型的构成比。 (6)阳性对照组，腹腔注射环磷酰胺(每天40mg/kg60mg/kg 体重)，或丝裂霉素C(每天 1.0mg/kg1.5mg/kg体重)。阴性对照组为受试物溶剂对照。其他操作程序同试验组。2.3.8.7.6 评价规定用2 检验或其他适当的显著性检验方法对所得试验数据进行统计学处理。 当各剂量组与阴性(溶剂)对照组相比，精子畸形率有显著性意义的增加，并有剂量-反应关系时； 或仅一个剂量组有显著性意义的增加，并经重复试验证实时，可判为该受试物对雄性生殖细胞具有遗传毒性。2.3.8.8 睾丸生殖细胞染色体畸变试验 2.3.8.8.1 目的利用细胞遗传学方法，以哺乳动物体内试验检测受试物引起的生殖细胞染色体损伤。 试验有小鼠精原细胞染色体畸变试验和小鼠精母细胞染色体畸变试验，可根据情况选做其一，或两者均做。2.3.8.8.2 试剂(1)受试物: 用水、植物油配成溶液，或用 0.5% 羧甲基纤维素钠制成混悬液。(2)阳性对照物: 常用环磷酰胺，或丝裂霉素。(3)秋水仙素(0.04%):取40mg 秋水仙素，溶于100ml 0.85% 氯化钠溶液中，过滤除菌。(4)甲醇/冰醋酸(3:1，V/V)固定液:临用现配。(5)枸掾酸三钠。 (6)姬姆萨染液:见2.3.8.2.2（9）。2.3.8.8.3 实验动物选用3 月4 月龄，体重25g30g 的雄性小鼠。动物总数不少于 25 只。2.3.8.8.4 试验分组受试物至少设3 个试验剂量组，每个剂量组5只动物。另设阳性对照组和阴性(溶剂)对照组。阳性对照组用环磷酰胺(40mg/kg体重)或丝裂霉素C(1.5mg/kg2mg/kg 体重)，腹腔注射。2.3.8.8.5 操作程序 (1)小鼠精原细胞染色体畸变试验，用经口灌胃方式，共染毒两次，间隔24h。 于第二次染毒后6h 处死动物。 处死动物前3.5h5.0h腹腔注射0.04%秋水仙素溶液，剂量为 4mg/kg体重。小鼠精母细胞染色体畸变试验，灌胃染毒，每天1 次，连续5d。 于第1 次染毒后的第 12d14d 将受试动物处死。处死动物前3.5h5.0h，腹腔注射0.04% 秋水仙素溶液(4mg/kg 体重)。(2)用颈椎脱臼法处死小鼠，取睾丸，去除脂肪。置含2.2%枸橼酸三钠溶液平皿中去除睾丸被膜，用针头使曲精小管松散。 一个动物的 2个睾丸可分别或合并处理。(3)用吸管尽可能去除2.2% 枸橼酸三钠溶液，将曲精小管置于含 3ml4ml 低渗液(1% 枸 橼酸三钠)的试管中。 10min后更换低渗液，以去除碎片和精子。在室温下，低渗时间总计不超过 25min。低渗结束后去除低渗液。加入预冷的固定液(甲醇/冰醋酸)，固定10min 后，更换固定液，再固定 10min。 第3 次固定至少30min，也可在冰箱中过夜。用镊子将已固定的曲精小管移到含50%醋酸 5ml的离心管中，吸管吹打至不透光，离心(1000r/min，5min)。(4)将固定液1.0ml1.5ml 加至离心所得细胞沉淀物中。 滴管吹打后，滴2 滴至用 70% 乙醇浸湿的玻片，分散后，热风干燥。(5)用姬姆萨应用液在室温染色10min，自来水淋洗两次。(6)以油镜检查染色体结构的异常情况。每只动物做两个睾丸，每个睾丸分析50 个中期分裂相精原细胞(或精母细胞)。记录观察染色体型和染色单体型染色体的结构异常。 对精母细胞染色体还观察相互易位、X-Y和常染色体的单价体。检查染色体数目异常时，记录非整倍体和多倍体。 在小鼠精母细胞染色体畸变试验时，只有当第一次减数分裂中，四倍体生殖细胞有一个被确认为四价体时才有意义。2.3.8.8.6 评价规定用 2 检验，或其他适当的显著性检验方法对所得试验数据进行统计学处理。 当各剂量组与阴性(溶剂)对照组相比，畸变细胞率有显著性意义的增加，并有剂量-反应关系时； 或仅一个剂量组有显著性意义的增加，经重复试验证实后，可判为该受试物对哺乳动物睾丸细胞具有致突变性。