宁波市自然科学基金项目可行性报告.doc

1先天性双侧输精管缺如发病机制研究概述先天性双侧输精管缺如发病机制研究概述郑邦旭，周黎明郑邦旭，周黎明*（宁波市妇女儿童医院生殖医学中心，浙江，（宁波市妇女儿童医院生殖医学中心，浙江，315000）摘要：摘要：不育症与心血管疾病、肿瘤已成为 21 世纪三大健康问题。其全球发病率约 10-15%，呈逐年上升趋势，已成为影响人类自身繁衍、人口素质提高和全社会和谐发展的重要原因之一。其中男性不育占其中一半。先天性双侧输精管缺如（CBAVD）是梗阻性无精子症（OA）的一种，有着正常的精子形成，但因双侧输精管缺如而致不育。目前 CBAVD 相关的研究报告少且不够全面，相关研究主要集中在基因突变与 SNP 方面。大量的研究表明，约 85% 的CBAVD 病例与囊性纤维化跨膜转导因子（CFTR）基因突变相关。然而，进一步的研究也表明，未携带 CFTR 基因突变的 CBAVD 患者很可能由其他基因和环境因素所致。全外显子组测序的方法为非 CFTR 基因突变的 CBAVD 患者筛选致病基因方面发挥重要作用。表观遗传因素是连接环境与遗传因素的桥梁。是一种不改变 DNA 序列但是蛋白表达发生变化的一种可遗传的形式。DNA 甲基化是不通过改变 DNA 序列而使基因表达发生改变的一种表观遗传修饰。目前有关 DNA 甲基化与不育的相关研究主要集中在精子生成及少弱精的机制研究方面，然而 DNA 甲基化与 CBAVD 的关联研究却鲜见报道。关键词：关键词：CBAVD；基因突变；SNP；甲基化；*通讯作者：通讯作者：周黎明：E-mail：zhou.li.ming163.com Tel：13605883969 1、先天性输精管缺如的概述、先天性输精管缺如的概述据世界卫生组织属下的人类生殖特别规划署统计，不孕不育症、心血管疾病及肿瘤并列为当今影响人类生活和健康的三大主要疾病。其中不孕不育症已成为影响人类自身繁衍、人口素质提高和全社会和谐发展的重要原因之一。不孕不育是一种特殊的生殖健康缺陷，近年全世界范围内不孕不育症发病率呈上升趋势，占已婚育龄夫妇的 10 %15 %，在我国不孕不育症人数也日益增多，发病率约为 15 %。据世界卫生组织的标准，夫妇婚后同居 1 年以上，未采取任何避孕措施，仍未受孕的称为不孕不育，其中由于男方原因造成女方不孕的，称为男性不育，约占整个不育因素的 50 %。而研究显示男性不育的影响因素包括：精索静脉曲张、原发不育、感染创伤、吸烟、遗传因素、免疫因素、梗阻以及先天形成，各因素所占百分比如图 1 所示1。先天性双侧输精管缺如(Congenital bilateral absence of the vas deferens, CBAVD)是梗阻性无精子症（Obstructive azoospermia, OA）的一种，占该病的近 25 %2。CBAVD 患者有着正常的精子形成，但因双侧输精管缺如而致不育，2占整体男性不育症的 1 %2 %3。CBAVD 患者临床表现为无精子症，触摸不到双侧输精管，伴有附睾的畸形、精囊腺的缺如等。CBAVD 可分为两类：第一类与囊性纤维化病(Cystic fibrosis, CF)明确相关，患者多以慢性肺部疾患、胰腺功能不足等就诊，检查时可发现典型的囊性纤维化病症状。第二类病因不明，临床多以不育就诊，而体检前未见其他异常4。对于 CBAVD 的治疗，目前并没有确实有效的治愈方法，对于 CBAVD 的发病机制也有待于进一步的研究。图 1: 男性不育影响因素2、先天性双侧输精管缺如相关遗传突变机制、先天性双侧输精管缺如相关遗传突变机制作为一种男性生殖系统的先天畸形，CBAVD 一直被怀疑可能与遗传因素有关，但是目前 CBAVD 的确切病因学和发病机制依然不清楚。CBAVD 被认为是囊性纤维化（CF）的非典型性症状，其中 97%的囊性纤维化病(CF)患者伴有先天性输精管缺如而导致的不育5，这提示囊性纤维化病相关的基因突变可能与输精管发育异常密切相关。研究已经证实第一类先天性输精管缺如患者由囊性纤维化跨膜转导调节因子(Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)基因突变引起。CFTR 基因编码的糖化跨膜蛋白是负责调控运输途径的氯通道。CFTR 广泛表达于外分泌组织的上皮细胞，如汗腺、肺、和输精管6。研究显示 CFTR 的异常表达会引发器官的功能障碍，包括汗腺、呼吸道以及生殖系统5。80-97 %的 CBAVD 患者具有至少一种 CFTR等位基因缺陷，50-93 %的 CBAVD 患者携带两种突变，包括 IV 类和 V 类CFTR 异常4,7,8。随着对 CBAVD 研究的深入，越来越多的 CFTR 基因突变被发现，如G542X，G551D，D1152H，M470W 等都与 CBAVD 的病因学有关系9, 10。关于CBAVD 风险的荟萃分析研究也得到了有趣的发现，其中涉及到的包括有 1139例病例及 1562 例对照的 29 项研究显示 CFTR 三个突变（5T、F508 和M470V）与 CBAVD 有显著的关联性，其中 5T 突变是法国、西班牙，日本，中国等人群的危险因素。CFTR F508 突变是加拿大，伊朗等白种人的重要的危3险因素，M470V 是英国，法国，中国及意大利人群的保护性因素5。此外，CBAVD 所涉及到的基因还包括 ABCC1011、TBX512、INS13、TP6314、NPY15、HNF1B16、EDN117、NPPA18、AR10、TH20、PANK22等。目前对于先天性输精管缺如方面的研究，具体来讲主要集中在基因突变及单核苷酸多态性（SNP）方面。基因突变方面包括目前已经发现的与 CBAVD有显著相关性的 CFTR 基因突变21，包括主要的突变类型如第 10 号外显子区域上的缺失突变（del F508）、第 8 内含子多聚胞嘧啶突变（poly-T）、以及M470V 突变等5,22。SNP 方面的研究显示 EDNRA 基因 SNP 中 rs5335 可以增加CBAVD 患者中 CC 二核苷酸亚型的表现率，可能与 CBAVD 患者的外显率相关23，EDNRA（内皮素受体 A 型）是一种蛋白质编码基因，编码内皮素 1 型受体，是一种有效及持久的血管收缩蛋白，主要存在于血管平滑肌，他们在血管收缩和细胞增殖中发挥作用。TGFB1 即转化生长因子 1 基因，该基因与囊性纤维化发病相关，并且调节细胞增殖，分化，粘附，迁移和其它功能。先天性输精管缺失（CAVD）的研究显示 TGFB1 多态性（rs1800470 与 rs1800471）能影响TGFB1 蛋白水平，其中 rs1800470 与 CAVD 表型相关。相比于在非梗阻性无精子症中确定的多基因疾病，CFTR 基因是唯一被确定的能够导致梗阻性无精子症的突变基因。但不孕的遗传研究存在着极大的局限性，传统的家系方法在实践中往往不能得到很好的结果，因为心理和文化因素同样影响着男性不育。全外显子组测序（whole-exome sequencing, WES）的方法，在寻找先天梗阻性无精子症新的致病基因方面克服了这一难题。然而，无典型囊性纤维化症状或身体貌似健康男性的先天性输精管缺如是否与 CFTR 基因异常有关，目前尚不清楚。Olivier 等应用了 WES 的方法分析了 12 个 CBAVD 患者外显子数据，这些患者已经证实为 CFTR 基因突变阴性。并且在 ADGRG2 基因中发现了三个阻断蛋白的半合子基因突变，分别是c.1545dupT (p.Glu516Ter)，c.2845delT (p.Cys949AlafsTer81)及c.2002_2006delinsAGA (p.Leu668ArgfsTer21)，ADGRG2 基因编码附睾及输精管特异性粘附 G 蛋白偶联受体 G2。其中有两个独立个体存在 X 连锁不育。以往的研究表明，敲除 Adgrg2 基因的雄性小鼠也表现出梗阻性不育，证实了ADGRG2 基因在男性不育及 CBAVD 中发挥重要的作用24。因此，对于无CFTR 基因突变的 CBAVD 患者而言，全外显子组测序可以作为一种筛查未知基因突变的有效手段。尽管已经证实一些基因特殊位点的突变可以导致男性不育，但最近的研究已经证实大多数不育并不是由于普通遗传的变异所引起的25。同时研究显示 CBAVD 的病因除了遗传因素外，还可能与环境等因素有关。3、男性不育的表观遗传学研究、男性不育的表观遗传学研究表型及环境因素之间的相互作用研究显示许多疾病是由表观遗传的改变所引起的，包括冠心病、肿瘤的发生等。研究表明，很多基因以外的因素可以引4起男性不育，包括睾丸后天损伤、慢性疾病、精神心理因素、药物和放射治疗、毒性化学物质以及环境影响等均可影响生育能力1。因此有学者提出，可以将表观遗传的改变作为研究对象来探究男性不育的病因26。DNA 甲基化是表观遗传修饰的一种，是不涉及基因组碱基序列的改变，而发生可遗传的表型变异的修饰方式，是在 DNA 甲基化转移酶(DNMT)催化作用下，以 S 腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将活化的甲基引入 DNA 链中，形成5-甲基胞嘧啶的过程。DNA 甲基化修饰，是调控基因表达开关的重要因素。CpG 岛分布于大部分基因的启动子区域，并且具有多种 DNA 甲基化形式。哺乳类动物基因启动子的 5末端含有 70 %的 CpG 岛，大多数都处于未甲基化状态。CpG 岛的甲基化会稳定核小体之间的紧密结合而抑制基因的表达27。已有的研究表明，低甲基化基因在组织中能表达，而基因启动子区域的高甲基化通常能沉默基因表达28。然而，先天性双侧输精管缺如是否是因为某些与输精管形成相关的基因启动子异常甲基化导致输精管相关基因的异常表达，从而引发输精管发育不全或无法形成输精管有待于进一步的研究。亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是一种重要的调控甲基化的酶，可以为DNA、RNA、蛋白质和脂类提供甲基，MTHFR 基因的多态性会降低 MTHFR酶的活性，从而造成甲硫氨酸活性降低和全基因组 DNA 的低甲基化。同时发现，53 %的少弱精（OAT）患者和一些先天性不育症患者存在 MTHFR 基因启动子高甲基化状态29, 30。在严重的精子缺乏患者中普遍存在异常的表观遗传变化，已经发现 PAX8、NTF3、SFN、HRAS、JHM2DA 等基因 DNA 甲基化改变与不育患者中异常的精液参数有关，这些基因通常是高甲基化的。目前有少数研究已经证实相关基因的甲基化水平的改变与男性不育相关。有研究证明，在成熟的精子中，与早期胚胎发育有关的一些关键基因的启动子是低甲基化的，Benchaib 等的研究已经表明精液中全基因组 DNA 甲基化的异常会对胚胎的生长发育产生影响31。Poplinski 等通过对 148 例不育症患者精液中的胰岛素样生长因子 2（IGF2）/H19、ICR1、MEST 进行甲基化分析，证实了 IGF2/H19、ICR1 的高甲基化和 MEST 的低甲基化都与精子数量的增加有线性关系，但是 MEST 的低甲基化比 IGF2/H19 的高甲基化能更好地反映精子数量的减少，并且只有 MEST 的高甲基化与精子活力、正常精子形态的损伤有关系32。成熟精子基因组中至少 96 %的 CpG 位点是甲基化的33，DAZL、CREM、MTHFR 和印迹基因启动子的异常甲基化状态和各种类型的男性不育以及精子缺陷有着紧密的联系34。然而 DNA 甲基化与 CBAVD 的关联研究却鲜见报道。4、展望、展望CBAVD 患者由于梗阻性无精子而不育，在梗阻性无精子症中，CBAVD 是一类相对独立的疾病，外科手术无法纠正，只能从附睾或睾丸中直接获得精子5进行辅助生殖。经皮附睾精子抽吸行单精子卵泡浆内注射(Intrcyplasmic sperm injection, ICSI)治疗，给渴望生育的 CBAVD 患者带来了福音。但 ICSI 助孕是跨越自然过程的受孕，避开了自然选择，理论上存在遗传危险性。从遗传学的角度考虑，对于隐性遗传病来说，ICSI 的助孕并不显著增加其发病率。同时ICSI 过程中环境的变化或化学物质干扰卵子的减数分裂和有丝分裂，接触环境中的化学物质可以引起突变或表观遗传学改变，从而引起子代遗传。DNA 甲基化是遗传因素和环境因素进行相互作用的桥梁。人类在母体内所处的早期环境以及后期的生存环境均可影响基因组 DNA 的甲基化修饰，进而调控相关基因的表达，最终影响疾病的发生和发展35。DNA 甲基化与男性不育的发生发展密切相关。环境因素可以通过改变 DNA 甲基化修饰来增加或减少男性不育的发病风险。随着对 DNA 甲基化研究的深入，我们对男性不育的相关环境致病因素的发病机理将会有更进一步的了解。DNA 甲基化与 CBAVD 之间的研究还不多，DNA 甲基化与 CBAVD 发病机制相结合的研究需要进一步加强。尽管如此，DNA 甲基化相关的研究和进展，给 CBAVD 的发病机制带来了新的研究方向，也为未来在临床上 CBAVD 风险的遗传咨询和治疗提供新的思路。6参考文献参考文献1.Male Infertility Best Practice Policy Committee of the American Urological A, Practice Committee of the American Society for Reproductive M. 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