实验动物的行为、应激和疼痛.ppt

实验动物福利和动物实验的伦理性要求,动物福利（animal welfare）是指人为提供给动物的相应物质条件和采用的行为方式，要保证动物在健康舒适的状态下生存，使动物处于生理和心理愉快的感受状态。,动物福利的渊源和内涵,一、动物福利的渊源19世纪初，欧洲的一些有识之士最早把同情的目光投向动物，并在法律实践中解决这个道德议题。1809年一位英国的勋爵提出一项法案，要求禁止虐待动物。这项法案在当时遭到人们的嘲笑，结果，虽然在上院获得通过，但在下院被否决。但是，随着时间的推移，社会的进步，人们关于动物利益的思考渐趋成熟。1822年，“人道主义者”马丁提出禁止虐待动物议案，真正获得上下两院通过，这项法案就叫马丁法（Martin Act）。马丁法是世界上第一个反对虐待动物的法律，首次认定虐待动物本身是一种犯罪，是动物福利保护史上的里程碑。人们对待动物的态度从此开始了微妙的变化。马丁法不仅影响到英国的民众，也影响到其他国家。1850年，法国通过了反虐待动物法律。与此同时，爱尔兰、德国、奥地利、比利时和荷兰等国家相继也通过了反虐待动物法律。1866年，美国成立了“禁止虐待动物协会”，并迅速通过了反虐待动物法案。,到了19世纪末开始以后，随着动物越来越多地用于生物医学研究的实验中，实验动物的福利就成了人们关注的焦点，各个国家相关的法律和条款相继颁布。美国联邦政府1966年颁布的动物福利法，正是在这种背景下出台的，经过1970、1976、1985、1990年的修订和增加条款，不断地完善。有关实验动物福利的主要内容大多包括在相关动物福利法中，有些国家也专门颁布了单行法，专门用于保障生物医学研究中实验动物的福利。如，1876年英国颁布了全世界第一部与动物实验有关的法律防止虐待动物法，以后又颁布了实验动物保护法、狗的繁殖法案等。美国联邦政府在1966年颁布了动物福利法后，1985年又颁布了改善实验动物标准法、卫生研究扩展法。在西方国家，实验动物福利的保障在这些法规的实施中得以具体落实。,二、动物福利的内涵 动物福利，一般强调保证动物健康、快乐的外部条件。当外部条件无法满足动物的健康、快乐时，就标志着动物福利的恶化。 满足动物的需求是保障动物福利的首要原则。动物的需求主要表现在以下三个方面：维持生命需要、维持健康需要和维持舒适需要。这三个方面决定了动物的生活质量。人为地改变或限制动物的这些需要，会造成动物行为和生理方面的异常，影响动物的健康，影响我们科学实验的真实性 。,解除动物的痛苦，让动物享有如下五大自由，是保障动物福利的基本原则：1 享有不受饥渴的自由。2 享有生活舒适的自由。3 享有不受痛苦伤害和疾病的自由。4 享有生活无恐惧和悲伤感的自由。5 享有表达天性的自由。,越来越多的公众和生物医学工作者都认可在研究中使用的动物，应该为它们提供适合的环境以及积极的心理经历，即满足动物福利的要求使它们保持在well-being（良好）的状态。良好状态是指动物的正常生活在没有威胁，并能满足它们眼前需求的情况，包括健康、社会和伦理学需要得到满足和满意，而疼痛、痛苦、苦难、健康恶化、恐惧、不舒服、功能剥夺、禁闭以及其它任何不愉快的条件、感觉或事件都是well-being（良好）反义词。,在这些所有的不愉快条件、感觉或事件中疼痛是最受到伦理学的关注，因为它本身本质上的恶，和可能是引起上述其它坏事后果的原因。至少100年来西方社会的大多数公众包括科研工作人员，还是认为他们对动物负有的伦理责任，是不得引起动物不必要或不合理的疼痛。关于动物使用的法律法规也将重点放在动物疼痛的伦理学问题上，要求合法目的地使用动物尽可能不引起动物疼痛，以及如果无法避免，不得引起动物不必要的疼痛。也就是说在实验动物福利保证和动物实验伦理学的框架内，疼痛是最敏感的伦理问题。,实验动物疼痛-不可忽视的伦理学问题,一、疼痛和痛苦的定义首先我们在实验动物疼痛相关的文献中常常遇到Pain、Distress和Suffering这三个词，准确的说它们的意思分别是疼痛、痛苦和苦难。后两个词虽然有区别但意思接近，Distress多指思想压力、紧张、恐惧、焦虑等所引起的精神上的痛苦，也指某种灾难（如疼痛）带来的痛苦；Suffering指身体或心灵感受的痛苦和苦难，以及各种苦恼、折磨，侧重精神或身体痛苦达到剧烈程度引起的状态。在文献中Distress和Suffering很少同时使用。 Pain、Distress和Suffering这三个词是描述人类大脑和思想感受和经历状态的一组词。将这种“思想”状态的定义移植到实验动物相应的状态是比较困难的，但科研工作人员必须知道疼痛、痛苦和苦难的概念，并且知道如何识别、评估、控制和有意识地尽量避免自己的动物经历这种感受。,1、疼痛（Pain），现行疼痛的定义是1979年IASP给出的，这个定义的认同性很高。“疼痛是一种伴随实际或潜在组织损伤的不愉快感官或情绪体验。”这个定义强调疼痛是个体一种生理学和心理学的经历和体验，它与大脑和脊髓功能变化激发相关联，即动物是处在清醒有知觉的状态。另外对动物疼痛的判断，是通过与疼痛反应相关的行为学变化进行，即所谓的非语言判定方式，实际上在人类临床对疼痛的判定上这个方式也非常有用。另外本书应用的疼痛定义，只局限于身体伤害性疼痛，是动物对伤害性刺激的感受或经历，即伤害性刺激的量值足以威胁或引起身体或组织损伤。,目前根据发展现状涉及疼痛按临床诊疗项目可分为：1）急性疼痛：软组织及关节急性损伤疼痛，手术后疼痛，产科疼痛，急性带状疱疹疼痛，痛风；2）慢性疼痛：软组织及关节劳损性或退变疼痛，椎间盘源性疼痛，神经源性疼痛；3）顽固性疼痛：三叉神经痛，疱疹后遗神经痛，椎间盘突出症，顽固性头痛；4）癌性疼痛：晚期肿瘤痛，肿瘤转移痛；5）特殊疼痛类：血栓性脉管炎，顽固性心绞痛，特发性胸腹痛；6）相关学科疾病：早期视网膜血管栓塞，突发性耳聋，血管痉挛性疾病等。,按疼痛程度的分类1）微痛 似痛非痛，常与其它感觉复合出现。如痒、酸麻、沉重、不适感等。2）轻痛 疼痛局限，痛反应出现。3）甚痛 疼痛较著，疼反应强烈。4）剧痛 疼痛难忍，痛反应强烈。疼痛性质的分类1） 钝痛、酸痛、胀痛、闷痛。2）锐痛、刺痛、切割痛、灼痛、绞痛。按疼痛形式的分类1）钻顶样痛。2）暴裂样痛。3）跳动样痛。4）撕裂样痛。5）牵拉样痛。6）压扎样痛。,2、痛苦（Distress），在“Guidelines for Recognition and Assessment of Pain in Animal”(UPAW1989)中，痛苦定义为动物处在一种不得不动用大量的精力或资源来适应性地应对来自环境或境况挑战和威胁的状态。这个定义与情绪或精神层面的疼痛（Suffering苦难）类似。动物的生存环境是由高于或低于可导致痛苦水平的各种因素构成，即动物生存环境中各种因素的改变超过一定的界限，都会引起动物痛苦，这也包括饲养和使用动物工作人员对动物采取的态度和行为。有时焦虑、挫折感或抑郁也包括在痛苦定义内，不舒服感也被看成是痛苦的轻度形式。在动物实验中，将动物的痛苦水平评估为轻、中和严重程度的做法，对于认识特定环境条件和实验处理，对特定动物带来的痛苦是多还是少，非常有帮助。另外重要的一点，动物痛苦的多少，与动物处理当前所处情形的机会和能力有关，即动物处理所遇情形的机会越多，能力越强，这种情形引起痛苦的程度就越低。,3、苦难（Suffering），是一种特定的“思想”疼痛或痛苦的状态，它不等于疼痛和痛苦，但可由它们而生。物理性（身体性）的疼痛或痛苦达到一定的强度或持续一定的时间，或二者兼有，就可导致动物的苦难感受。疼痛和痛苦的强度越大，导致动物苦难所需的时间越短。苦难是疼痛和痛苦达到动物个体不能再耐受的程度，即身体疼痛的水平超过动物个体耐受的阈值，或痛苦水平超过动物个体能处理适应的能力，引起的对动物的伤害效应。在这个阶段，伤害效应包括非常明显的生长停滞、繁育损害以及不正常的身体护理行为。从这个定义，很明显防止苦难的产生，就得一定使动物可能经历的疼痛可痛苦保持在动物能耐受或处理的水平之下。,二、对待实验动物疼痛的伦理学原则在使用动物进行科学研究时，关于实验动物疼痛的伦理学考虑必须遵守一些原则性的条款。但最重要的还是我们应当树立正确的伦理学理念，其次才是了解掌握这些原则的应用和实践。动物实验引起动物疼痛有时是无意的，而有时是有意的，如关于疼痛或者引起疼痛的某些疾病的研究。虽然关于故意引起动物疼痛的科研需要对这些原则的含义更深刻的理解，并给出专门的意义。但这些原则除了适用于一般动物实验外，也适用于故意引起动物疼痛的实验。,1、疼痛在实验动物伦理学框架中的中心地位越来越多的公众和生物医学工作者都认可在研究中使用的动物，应该为它们提供适合的环境以及积极的心理经历，即满足动物福利的要求使它们保持在well-being（良好）的状态。在这些所有的不愉快条件、感觉或事件中疼痛是最受到伦理学的关注，因为它本身本质上的恶，和可能是引起上述其它坏事后果的原因。关于动物使用的法律法规也将重点放在动物疼痛的伦理学问题上，要求合法目的地使用动物尽可能不引起动物疼痛，以及如果无法避免，不得引起动物不必要的疼痛。也就是说在实验动物福利保证和动物实验伦理学的框架内，疼痛是最敏感的伦理问题。,2、相等原则（Equality Principle）几个重要的伦理学原则都源自疼痛本身是一种内在的罪恶，并不仅仅它产生各种不同恶的效应而恶这个事实。相等原则的含义是疼痛感受的强度或持续的时间或严重程度与任何生命（包括人类和动物）遭受的罪恶程度是相等的。正如哲学家Joel Feinberg解释的那样：如果疼痛和痛苦本身的基本特征使它们恶，那么罪恶并不是因为它们的后果，而是因为它们内在的本质，那么无论疼痛和痛苦什么时候什么地方发生，它们给与的程度大小和它们本身罪恶的大小是相等的。如果在某些特定的情况下，低等动物物种比高等动物物种经历的疼痛要少，我们当然可以考虑，在可能引起动物疼痛（不管是无意还是故意）的实验中使用低等动物，使罪过更小，更容易达到正当性原则的要求。,3、正当性原则（Justification Principle）因为疼痛本质上是罪恶，任何人引起动物疼痛，都必须说明引起动物疼痛的必要性和合理性，这就是正当性原则。Feinberg写道：谴责和极力避免在其它动物身上引起不必要的疼痛，最简单的原因就是我们将疼痛和痛苦认为是本质上的罪恶。也就是说疼痛和痛苦之所以为罪恶就因为它们是疼痛和痛苦。在人类处在疼痛的状况时，我们会毫不犹豫不需要任何理由去极力避免或纠正所处的恶劣状况，谁也不会在此时问及“疼痛错在哪儿？”这样愚蠢的问题。没有任何合理、必要的理由去伤害另一个物种，可能是所有错误里面最错的一种伦理错误。疼痛是一种罪恶，如果我们出于自身利益或其它动物利益的目的，引起一种动物不必要和不合理的疼痛，那么我们一定是在犯罪。很难一般性地说需要多有力的理由才算合理正当，才可以引起动物疼痛，但这个原则告诉我们引起动物疼痛不是件小事，必须具有强有力的必要性、合理性和正当性。这个原则的应用需要以下原则的配合。,4、价值原则（Value Principle）紧接着疼痛是一种罪恶，以及正当性原则，是另一个关键的伦理学原则，即价值原则。这个原则也是IACUC和伦理委员会审视那些可能引起动物疼痛的研究时，常常援引的原则。由于疼痛是罪恶，疼痛越严重罪恶就越重（相等原则所述），那么动物疼痛严重程度越高的动物实验，必须的合理理由就越要充分（正当性原则所述）。价值原则是指对引起动物疼痛越多的实验，对实验本身的价值要求越高。在判断引起动物疼痛的研究是否合理时，价值由两种元素构成。一是研究目的的价值，二是研究的科学完备水平（也叫科学价值）。为证明引起动物疼痛的合理正当，除了有高的研究目的价值外，还要具备科学完备和严密的实验方案和操作指导，包括操作人员有能力胜任研究工作。,5、最小化原则(Minimization Principle)在所有的伦理学原则中，现行法律和规章应用最多的就是我们称之为“最小化原则”。它的含义是应当使研究用的动物体验量值最小的疼痛。假如，一个人做伤害动物的事有正当的理由，那么伤害小总比伤害大好，小伤害小疼痛小罪过，这就是伦理学的最小疼痛原则。一个人引起动物疼痛是正当的，但引起超出研究需要的疼痛就不正当了。最小原则是继价值原则后伦理学的最佳考虑。由于某种数量级的疼痛确实是必要的，那么是否引起动物疼痛是正当合理，由研究的方案决定，即当疼痛是必要的时，要求方案中制定引起的疼痛是最小的。最小化原则要求尽可能不引起动物疼痛，无痛是最小化原则的最理想状态。当确定是否一种方式能将疼痛最小化，难点在于很难将经历的一种疼痛和另一种在数量上加以比较，那么我们必须回到直觉的判断上，找到解决的办法，即从动物经历疼痛后相关的行为学证据来判断疼痛的大小。由于最小化原则的潜在动机是保证动物感觉比必要正当的疼痛不坏，因此这个方法看来是合理的。,6、个体公平原则（Fairness to Individual Animals）最小化原则必须附加另一个重要的伦理学原则，即下面讲的个体公平原则。疼痛“最小化”可能会使有些人认为真正的伦理学关心的是动物经历疼痛的总量，并且我们为这个总量负有道德上的责任。引起动物疼痛伦理学问题的出现，并不来自于引起动物疼痛的总量，而是来自于引起动物个体的疼痛。个体感受着疼痛，这种感受不能分担，是什么使疼痛成为罪恶，是因为个体经历这种罪恶。因此在确定引起动物疼痛是否合理正当时，我们还必须问自己对使用的每一只动物是否公平地对待了。有时，个体公平原则的考虑还意味着，如果我们使每只动物疼痛少些，也能完成同样目标，而如果我们使每只动物遭受大量的疼痛，就是在犯伦理错误。,三、疼痛和痛苦的表现与界定了解掌握动物疼痛和痛苦的表现指标，我们才能对实验中动物经历的疼痛或痛苦辨别和界定，进行准确的评估，从而为我们应用以上伦理学原则提供依据和打下基础。虽然有些动物在经历疼痛和痛苦时会发出声音，甚至有特征性的面部表情，但各种实验动物缺乏声音交流主观报告的能力，来表明它们的“思想”状态和经历，所以我们常常根据动物行为和外观的改变、活动和伤害防卫反应的异常来推断它们经历疼痛和痛苦的状况。有时还附加上疼痛相关的生理学和生化指标，来帮助我们判断。尽管目前相对人类疼痛的判断体系，这是一个被称为比较粗糙的方法，但对人类疼痛最有效的医学筛选系统也是通过眼睛观察而定而非语言交流。,1、行为学和外观实验动物的疼痛不总是那么明显，应该随时注意观察它们的外观和行为，将有助于识别判断疼痛的表现。关于动物实验处理和操作方面的知识，对这方面的评估判定非常有帮助，记住“除非有相反的例证，研究者应将引起人类疼痛和痛苦的操作，视为同样引起其它动物疼痛和痛苦”（IRAC1985年）这句话。Morton 和Griffiths1985年提出一个由行为和外观一般性观察评估判定疼痛和痛苦的一个指标体系，至今仍在广泛地应用。这个体系的指标包括体重变化、身体外观、临床症状、非刺激（先天性）行为变化、对外界刺激的反应。,1）体重变化体重变化指标一般包括两项：一是体重的减轻程度，二是饲料/饮水消耗减少程度。动物经历疼痛会变得食欲不振，采食量减少，体重减轻。一般体重减轻在原体重的10%以下，动物经历疼痛为轻度；减轻在10%-25%，疼痛为中度；减轻超过25%，疼痛为严重。,2）身体外观身体外观指标也包括两项：一是身体姿态，二是皮毛状况。一般啮齿类和兔形目动物经历疼痛时都会出现拱背的身体姿态，局部实施外科手术的动物，我们还可以观察到身体受影响部位的疼痛特征，如将身体较小重量放在受伤肢体的姿态改变或行走步态改变，还可能对受伤部位舔、抓挠、和咬的状况，当然这些状况也有可能是身体局部瘙痒引起的表现。皮毛状况，主要观察毛发是否紧贴皮肤、光滑。毛发竖立，皮毛粗糙，脱毛、掉毛，都可能是疼痛的影响造成。,3）临床症状临床症状包括可观察到的异常行为和生理学指标，疼痛可能引起动物呼吸急促，流涎（涕），震颤，痉挛，排尿、瞳孔扩大，打喷嚏、流“红泪”等不正常的生理学变化；也可引起自残，侵略性和发声增加，躺卧不动等异常行为症状。,4）非刺激行为非刺激行为包括与同类个体互动交流的社会行为，以及发声状态。疼痛会导致动物与其它个体的互动交流的社会行为减弱，比如互相追逐玩耍、互相梳理毛发行为的减弱，甚至厌恶同类。并可能改变原来正常的发声方式和状态，发出的声音可以用哭喊、尖叫、嚎叫和狂叫来描述。,5）对刺激的反应对刺激的反应主要是指受到外界刺激时动物的反应行为表现。经历疼痛的动物在受到外界刺激时一种是反应性行为降低甚至没有任何正常的行为反应，而另一种是肢体警戒姿态、攻击性行为，吃仔，或抓咬挣扎。,2、生理学疼痛引起的生理学指标的改变，有的需要一定的测量手段，比起用眼睛观察的指标显得复杂了一些，但对疼痛的评估和判定是非常有帮助的。包括体温、心跳、呼吸、血细胞计数、血细胞分类、心输出量、血流量等。疼痛引起的植物神经系统的反应，导致血压和心跳增加，瞳孔扩大等生理学指标的变化，也会使肌肉张力（Muscle tone）肢体温度改变，体表血流量增加。,3、生化 疼痛引起的血液中激素水平的改变构成了疼痛评估和判定的生化指标。这些指标需要更复杂的测量技术和手段，和生理学指标一样，在一般性的实验动物饲养管理和动物实验中并不常用来作为疼痛评估和判定的依据，但在一些特殊的研究中，生化指标是重要的评价依据，尤其用在对痛苦的评估和判定。包括血清中促肾上腺皮质激素（ACTH），皮质类固醇和儿茶酚胺升高，性类固醇下降。但是它们与疼痛的关系并不是最精确的，可能其它的应激因子也会引起类似的生化反应。,大鼠,小鼠,豚鼠,地鼠,兔,Beagle犬,非人灵长类 有人在现场的情况下，非人灵长类对外科操作或损伤 反应不太明显，看似很好，疼痛很严重时才表现明显。因此从远处观察或用录像记录对发现微小的临床变化是非常有帮助的。如果非人灵长类表现出疾病的状态，就一定是非常严重，需要迅速做出反应。 非人灵长类疼痛时一般表现出悲伤和沮丧的外表。它蹲伏畏缩成一团，两只前臂交叉抱在胸前或头前，表情“悲伤”，愁眉苦脸，目光呆滞，呻吟或叫喊，躲避同伴，停止梳理。猴在疼痛时会做出吸引同笼伙伴的行为，表现从缺乏社会性梳理到攻击同伴不同程度的社会行为。动物急性腹痛时通过表情来表现，磨牙、躁动和伴有呼噜声或呻吟声的身体发抖。头痛时动物会将头部压向围墙或笼壁表面。灵长类疼痛时通常拒绝食物和饮水，如果动物是经过调教和社会化训练的，改变合作人员和操作指令也会引起动物痛苦表现。,鱼由于传代快、饲养空间小容易控制和较少的法律限制，近些年用鱼类进行的实验研究工作增加的非常迅速。但关于鱼类疼痛和痛苦的知识还很少。 对于鱼类慢性疼痛的特征化研究工作还非常少。对急性刺激如皮下针刺鱼类会表现出很强的肌肉反应。当放入到有害环境如弱酸性水中时，表现出不正常的游泳行为，企图跳离水面，以及更快的鳃盖张合运动。身体损伤时，会在容器底部不断晃摆身体，摩擦受影响的身体部位。,四、实验动物疼痛和痛苦的产生在实验过程当中使实验动物保持在良好健康、满足福利要求的状态，了解动物疼痛和痛苦产生的原因，有时比了解它们的表现还要重要和有帮助。环境的改变、实验的处理、实验动物饲养管理以及设施运行许多细节方面的不当，都可能引起或增加动物疼痛和痛苦的发生。,1、运输我们常常遇到，实验动物在运输中途或到达后死亡、发病，行为、内分泌以及免疫指标发生变化，这表明运输过程对动物来说，是一种明显的应激、疼痛和痛苦经历。以安全无应激的方式将动物从供货商运输到实验室，对保证动物的健康和福利，以及研究工作的有效，都非常重要。对实验动物的运输，许多国家的动物福利和保护法律有条款规定，如美国的动物福利法（AWA/AWR），欧洲议会关于动物运输期间的保护制度（ETS 193）。另外国际航空协会（IATA）关于活动物运输的规定，已被包括美国在内的很多国家官方采纳。运输中引起动物的问题常常使我们不知所措，这里建议科研工作者，对于来到实验室的动物应该了解运输的过程。,1）运输笼具用于运输的笼具要求必须能防止动物受伤和逃出，比起饲养的笼具，空间上可能要小一些，动物的活动空间受到一定的限制，但动物在其中，必须能转身、躺卧和进行正常姿势的调整，因此运输笼具大小应该符合这一要求，并在运输时考虑适当的动物密度；运输笼具结构比较复杂，要求考虑四个方面：1要有可观察动物的视窗，用于随时对笼内动物情况的观察；2通风面积要能保持笼内空气流通，有防止通风窗阻塞的装置；3 有饲料和饮水供给装置，能使动物在长时间的运输过程中方便采食和饮水；4 构造上要求能有利于保持清洁卫生，并有不易丢失的标识。用于啮齿类动物的笼具，内部要铺垫料，运送SPF动物的笼具还需要装过滤介质，对空气进行过滤，防止在运输途中动物发生感染。而用于大型动物的运输笼具多为带有饮水（防漏洒）和饲喂装置、网底（带粪尿接盘）构造金属笼子。运输笼具引起动物应激和痛苦的主要原因是：空间太小，动物正常行动受限；空间小密度大空气不流通缺氧；空气不流通，笼内温度过高；没有饲料和饮水的供给，忍受饥饿；微生物感染得病等。,2）运输工具和运输时间 动物运输可能采用陆地运输、航空运输以及两者组合的方式。最好的运输方式是供货商用专用的实验动物运输车直接将动物运到实验室，这种专用运输工具能在运输途中可控制温湿度、空气流通以及噪声和有害因素对动物的影响，减少疾病感染的几率，将动物由于运输产生的应激降到最小。但许多情况下我们不得不借助，公共交通工具运输动物，甚至有时动物用陆路交通工具运到机场，再用飞机运到目的地机场，再乘车回到实验室。这种环节多，搬运频次多，大部分环境因素无法控制的运输方式，对动物的影响非常大，再加上有时无法避免的晚点，动物出问题的几率是比较大的。由于动物在运输途中生存环境可控性降低，因此运输的时间越长，引起问题的可能性越大，需要考虑的问题越多，比如超过啮齿类动物超过4个小时的运输必须供给饮水，超过8个小时的运输必须提供饲料和饮水。,3）温度和噪声采用公共交通工具运输动物，最难以控制的除了时间长短外，温度和噪声也是引起动物应激和痛苦的主要因素。一般环境温度超过30，运输对动物非常有害，因此必须考虑选择环境温度适宜的天气和季节运输动物。在温度较高情况下（25-30）运输动物，要增加动物饮水的供给，还要降低动物的密度，保证笼内空气的流通。而噪声在运输途中几乎是不可控的，留给我们选择的空间很小。4）食物和饮水长时间的运输过程，要保证动物充足的饮水和食物，避免动物在运输中经历饥饿和干渴。饲料供给装置比较特殊，要防止动物取食时将饲料散落在笼底，造成食物污染。饮水要防止滴漏，将笼内弄湿，让动物经历“泥泞”和湿闷的不良感受。,5）其它 有研究表明，动物运输引起的动物应激，在有些情况下会加重。实际上，动物从繁殖单位的笼子转移到运输笼子，再到使用单位放入实验笼子。搬动的次数很多，而搬动人员大多不是实验动物专业或有这方面知识的人员，颠簸晃动会使动物不舒服；另外运输过程大多数情况下，使动物脱离了它所熟悉的社会关系，不但物理环境变得陌生，心理环境也变得陌生；都会加重应激的产生。因此，在国际航空协会（IATA）关于活动物运输的规定中，对动物的搬运操作做了严格的规定，另外，我们应该提醒供货商，动物在装运输笼时，尽量不要打乱原有的社会关系。大动物的运输安排配对关放，比如灵长类动物，熟悉的雌雄同笼运输或熟悉的年轻个体两只同笼运输，比起单个个体一笼分开运输要好的多。,2、环境因素1）大环境因素通过控制环境和进行标准化的管理，使动物避免经历许多潜在应激因子，可以解决动物在极端环境中引起的疼痛和痛苦。但一般来说，繁殖单位对环境控制要比实验单位严格一些，这可能造成动物进入实验单位的设施后，面临一个全新的环境。环境温度、湿度、光照（尤其对夜行性动物）和噪声等大的改变都是动物重要的痛苦来源，并且有些可以引起急性疼痛。Whary 及其同事（1993）关于啮齿类应激的研究表明“最重要的应激因素是居住环境和饲养管理的突然改变，而不是居住环境和饲养管理本身。”表中所列的因素，都是研究结果证明的事实。在环境的控制方面，注意有时候一些细节和表面上无害的操作都可能引起动物痛苦和啮齿类动物的异常行为，比如，将小鼠靠近大鼠放置，天敌气味会使小鼠变得紧张恐惧，超声波的清洗设备运行，吸尘器的使用，都会是噪声的来源，引起动物痛苦。,表 新环境中可能引起动物应激的因素,2）微环境因素动物生活的微环境可能是变化最多的方面，这些变化对动物的影响有时候会是负面有害的。笼具设计和结构对于动物的良好健康有较大的影响，其中动物活动锻炼机会的均衡，同笼伙伴直接接触和逃避的实现，非常重要。虽然清洗笼子可以降低氨气的浓度，但换笼操作本身不但打乱了动物的生活宁静，还破坏了动物气味遗留方式。保证动物个体生活微环境的稳定也很重要。我们知道，啮齿类动物重新建立新的社会关系的过程，就是一个强度较高的应激过程。清洗笼具后，在群居的雄性之间会出现短暂的斗殴，固定的光周期（L/D）可将这种反应降到最小。实际上，破坏动物遗留的气味比起不更换笼具有时更容易引起动物痛苦，因此在实际的管理中，我们必须仔细平衡频繁更换动物生活内环境与内环境清洁之间的矛盾。同笼动物伙伴之间的互动是有益的，但实际上对独居的反应与动物种属和发育阶段有关。有些情况下同居反而是疼痛和痛苦的来源，比如啮齿类和兔形目动物雄性和哺乳的雌性同居。有时候，动物个体之间的斗殴追逐也并不是坏事。尽管斗殴在一些物种中相当普遍，但绝大多数动物都倾向使用非损伤性的攻击模式解决同种个体之间的矛盾，是动物社会改善应激的抗伤害机制。另外，大鼠和小鼠都可以通过嗅觉信号在个体之间传递交流疼痛和痛苦的感受，甚至引起邻笼同种动物的焦虑。,3、实验操作实验操作和日常的饲养管理操作是实验动物明显的应激源，没有应激就不可能发生痛苦，但不是所有的应激都产生痛苦。只有当应激的生物学代价对动物保持良好健康状态的关键生物功能造成负面影响时才发生痛苦。因此引起在实验过程中引起动物应激可能是无法避免的，但避免引起动物疼痛和痛苦是可以做到的。,1）饲养管理操作饲养人员换笼、分窝、给水、饲喂以及其它接触动物的操作，对动物来说都是小的应激因子，尤其动物熟悉的专业固定人员操作，不会成为引起动物疼痛或痛苦的因素。但在动物饲养管理操作中如果许多小的应激因子累积到一起就足以引起痛苦发生的生物学代价。比如给动物换一个新的笼子对动物来说只是一个无关紧要的，没有伤害的操作，但如果这一时刻，几种类似无伤害的操作结合一起完成，如换笼的同时将动物离乳或分窝，动物可能就会感受到痛苦。认识这种多个应激因子累积的效应，对建立实验动物管理规范和操作程序非常重要。,2）实验操作 实验操作是引起动物疼痛和痛苦的主要因素，很难为这些大量不同的操作列出一个明确的清单，而且各种操作引起疼痛或痛苦的严重程度明显各不相同。下表列出的只是我们试图在这方面的一次努力，另一个要说明的是这些操作都是专业人员的操作，而非专业人员的操作引起动物疼痛和痛苦远不如此。,4、实验目标有些研究目标就有意或无意包含了动物的疼痛或痛苦感受，动物似乎无法避免疼痛或痛苦，虽然在伦理学的评估中遇到的问题最多，却意味着我们伦理学的责任越大。1）疼痛研究疼痛研究是一类对解决和缓解人类和动物疼痛和痛苦，意义重大的研究工作。在动物身上有意引起疼痛或痛苦，是这类实验的主要特征。2）疾病模型将正常动物变成模拟人类疾病状态的动物模型，是生物医学研究疾病的一个重要手段。这种以认识疾病本质找到治疗方法为目标的研究工作，虽然不是有意引起动物疼痛或痛苦为研究目标，但由疾病过程给动物带来的疼痛和痛苦，是这类研究的重要特征。如前面所列的动物模型中由炎性引起的疼痛以及由癌症肿瘤引起的疼痛和痛苦，还有其它疾病引起的内脏性疼痛，在疾病研究的动物模型中也是经常存在的。,3）毒理和药理研究出于开发新治疗药物的研究目标，经常会用动物来对未知化合物的毒性和药理作用进行研究。这类研究会让动物全身或身体局部直接接触可能有毒性的化学物，毒物对动物生理甚至解剖结构的扰乱或伤害，引起动物疼痛的种类也是多种多样的，有急性也有慢性，有全身也有局部，有外部也有内脏性的。这类研究目标引起的动物疼痛和痛苦，越来越引起人们的关注，在伦理学的处理方面，也有越来越多的深入研究。,动物实验的3Rs原则,RUSSEL 和BURCH 1959年在其PRINCIPLES OF HUMANE EXPERIMENTAL TECHNIQUE著作中首次完整提出科学研究中动物实验的3Rs原则。即用其他方法代替动物实验（REPLACEMENT）；减少动物使用的数量（REDUCTION）；优化（REFINEMENT）实验过程减轻动物痛苦。,对动物实验中伦理学问题的争论和讨论，结论之一是每一个从事研究的人员有义务和责任寻找替代动物实验的其他研究方法。但在目前的情况下，完全不进行动物实验又是不现实的。因此，对于动物实验的伦理学评价机制建立了起来，努力在人类利益和动物利益之间找到相对的平衡。在动物内在价值越来越受到尊重的今天，人类面临动物实验不能做又不得不做的两难境地，符合伦理学法则的3R提出，也许是一个必然的事情。,3Rs原则的提出，对一些西方发达国家有关实验动物法律法规的修订和补充产生了积极的影响。同时3Rs原则还在生物医学科研计划和实验程序的伦理学评估和论证中普遍被采用。科研人员尽管有按自己独特方法开展研究的权利，但他们只能在动物福利法规的框架范围内享有学术自由和最优化地使用动物。在西方国家普遍实行对申请和实施研究的方案进行伦理学评价，颁发许可证的制度已经成为在科研中实践3Rs原则的重要组成部分。,目前，3Rs的概念和理论已经被越来越多的科研工作者所接受，相应出现了一些有关的基金组织、出版物以及举办国际或地区性的学术会议，还有专门从事研究3Rs的机构和人员队伍。如果说过去人们强调3Rs主要出于对动物福利的考虑，那么近年来明显的变化是人们逐渐认识到应用3Rs不仅是适应动物保护主义和对动物伦理学责任的一种需要，也符合生命科学发展的要求。,3Rs理论应用和发展,1、体外技术2、低等动物代替高等动物3、免疫学技术4、物理化学方法5、数学和计算机模型6、人类模型7、遥测技术8、分层分析9、其他替代方法,表1 荷兰疫苗技术的的进步对使用猴数量的影响年代 技术 每年用猴数1965                 -使用进口的猴用胰蛋白酶体内消化分离细胞 4570-单层贴壁细胞培养1970 -用微型SEPHADEX器代替贴壁培养 15901975 -用捕获繁殖的猴代替进口猴 4631980 -用三级培养代替原代培养 -用体外胰蛋白酶消化代替体内消化 47 -灌注渗透技术的改进 20现在 -用细胞株代替细胞培养 0,计算机预测,皮肤腐蚀,停止,阴性结果,pH,11.5pH2.0,体外试验,无腐蚀性,体内兔皮肤试验,无腐蚀性：皮肤评价和眼刺激,11.5或2.0,皮肤腐蚀,皮肤腐蚀,停止,停止,停止,安乐死,对安乐死方法的要求：1、人道2、对科学实验结果没有影响3、可靠、有效 4、经济、容易实施 5、对实验人员必须安全,安乐死的方法: 1、药物化学法2、机械物理方法,动物实验的人道终点（HUMANE ENDPOINT）"toxicologic and biologic testing, cancer research and infectious disease investigation may, in the past, have required continuation until the death of animal. However, in the face of distinct signs that the processes are causing irreversible pain or distress, alternative endpoints should be sought that satisfy both the requirements of the study and the needs of the animal" (CCAC 1989, p. 2).,是否有办法减少经历非缓解疼痛和痛苦的动物数量呢？最近人们在国际会议上进行了讨论，认为可以通过尽早结束实验，而又不影响科学研究的目标实现和有效性。最理想的人道终点其标准是在动物的疼痛和痛苦发生前就结束实验。当疼痛减轻药物不能使用的情况下人道终点的发展和使用可以减轻和缩短动物经历疼痛的程度和时间。,将垂死状态作为实验的终点许多实验伴随着高死亡率或产生进行性或严重的疾病导致动物死亡。确定垂死状态，并将其作为有效的实验终点，避免用死亡作为实验终点，减少不必要的疼痛和痛苦。,如果人们能准确预测动物死亡的时间，安乐死就可按时间表的安排进行，这样可以按准确时间规定搜集那些由于动物意外死亡而不能得到的样品。例如，最近对患有柔脑膜肿瘤的大鼠的研究用后肢麻痹而不是死亡作为实验终点，因而可以收集用于研究肿瘤范围和可能对治疗反应组织学记录必须的组织。另外，迫近死亡可以改变重要的生理学变量，在这种条件下使得收集的数据在整个研究的整体中成为不正常的甚至不可解释的数据。例如，微生物感染的小鼠接近死亡时会发生明显的体温过低并有不正常的EEG出现，使这些小鼠变成生理上不适合做一些实验。,先发制人式的安乐死对研究工作有几方面的好处：在出现严重的生理功能打乱后，收集的数据可能对有些实验目的来讲是无用的或起误导作用的，并且分析收集的组织死后可能会消失。如果研究团队对在研究的终点准时进行安乐死的意义都有充分认识的话，那么无疑按照已有的终点标准较容易建立起实验的终点。最终，临死状态的明确定义也能提高兽医和动物饲养管理人员对动物健康管理和有效收集高质量数据的能力。,最常用实验动物-小鼠的故事,Mendel1900,William CastleBussey,Harvard1900-1928,Clarence Little,Jackson Laboratory Bar Harbor, Maine1929-now,Abbie LathropGranby,Massachusetts1900-1918,49 L.C. Dunn, Clarence Little, Sewall Wright, George Snell,国际行为遗传学学会成立于1997年学术刊物于2001年1月发行第一期月刊名称为Gene，Brain and Behaviors网址：G2B.org,