9核酸的生物合成.ppt

DNARNA蛋白质蛋白质复制复制复制复制转录转录反转录反转录翻译翻译第九章第九章 核酸的生物合成核酸的生物合成第九章第九章 核酸的生物合成核酸的生物合成复制复制(replication)(replication)：以亲代双链以亲代双链DNADNA为模板，按照碱基互补配对的为模板，按照碱基互补配对的原则，合成出与亲代原则，合成出与亲代DNADNA相同的双相同的双链链DNADNA分子的过程。分子的过程。DNA半保留复制的实验依据半保留复制的实验依据 含含N15-DNA的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代 DNADNA生物合成时，亲代生物合成时，亲代DNADNA解开为两股单解开为两股单链，各自作为模板链，各自作为模板(template)(template)按碱基配对规按碱基配对规律，合成与模板互补的新链。在子代律，合成与模板互补的新链。在子代DNADNA分子分子的两条链中，的两条链中，一条来自亲代，另一条是新合成一条来自亲代，另一条是新合成的的，这种复制方式称为，这种复制方式称为半保留复制。半保留复制。半保留复制的概念半保留复制的概念半保留复制的生物学意义半保留复制的生物学意义生物的遗传信息通过生物的遗传信息通过DNADNA复制，亲代复制，亲代DNADNA的的一条链保留在子代一条链保留在子代DNADNA分子中，新合成的链与分子中，新合成的链与亲代链碱基配对，从而亲代链碱基配对，从而使生物的遗传信息稳定使生物的遗传信息稳定地进行传递。地进行传递。（1） DNA聚合酶聚合酶 多功能酶：多功能酶： 5 5聚合酶活性聚合酶活性 对复制和修复中出现的空隙对复制和修复中出现的空隙进行填补；进行填补； 5 5 外切酶活性外切酶活性 对复制中的错误进行校对，对复制中的错误进行校对，保证复制准确性；保证复制准确性； 5 5外切酶活性外切酶活性 去除去除RNARNA引物和突变碱基。引物和突变碱基。 主要功能是负责主要功能是负责DNA的损伤修复。的损伤修复。323 aa小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 605 aa5 DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶DNA聚合酶聚合酶 928 aa（2）DNA聚合酶聚合酶II 具有具有5 5聚合酶活性聚合酶活性和和5 5 外切酶外切酶活性，没有活性，没有5 5外切酶活性外切酶活性。 只是在无只是在无polpol及及polpol的情况下暂时的情况下暂时起作用。起作用。 对模板的特异性不高对模板的特异性不高, , 参与参与DNADNA损伤损伤 的修复的修复。 （3）DNA聚合酶聚合酶III催化催化 E.ColiE.Coli DNA DNA复制的复制的关键酶。关键酶。由由1010种亚基组成不对称的聚合体。种亚基组成不对称的聚合体。，亚基组成亚基组成核心酶单体核心酶单体；亚基亚基具有具有5353的聚合酶活性；的聚合酶活性；亚基亚基具有具有3535外切酶活性和碱基选择功能；外切酶活性和碱基选择功能；亚基亚基可刺激可刺激亚基亚基的外切酶活性。的外切酶活性。亚基亚基(DNA(DNA夹子夹子) )能夹稳模板链，负责将核能夹稳模板链，负责将核心酶结合在心酶结合在DNADNA双链并沿双链并沿DNADNA模板滑动。模板滑动。其余亚基统称为其余亚基统称为-复合物复合物, , 促进全酶的组促进全酶的组装及增强核心酶活性。装及增强核心酶活性。DNA聚合酶聚合酶 5353聚聚合活性合活性3355外外切切核心酶核心酶DNA夹子夹子-复合物复合物催化催化DNA聚合聚合参与参与DNADNA损伤损伤修复修复 损伤修复损伤修复切除引物切除引物功能功能2040400分子数分子数/细胞细胞+5 外切酶活性外切酶活性+ 5 外切酶活性外切酶活性+5 聚合酶活性聚合酶活性 III II IE. Coli 中的中的DNA聚合酶聚合酶E. Coli 中的中的DNA聚合酶聚合酶、主要参与主要参与DNA的修复。的修复。（4）真核生物的）真核生物的DNA聚合酶聚合酶引物合成。引物合成。复制的主要酶。复制的主要酶。参与参与DNADNA的修复。的修复。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。线粒体线粒体DNADNA复制。复制。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 依赖依赖DNADNA的的RNARNA聚合酶，聚合酶，。可以催化游离可以催化游离NTPNTP聚合形成聚合形成小片段小片段RNARNA，。催化催化RNARNA引物的生成，对于引物的生成，对于DNADNA合成是必需的，合成是必需的，在大肠杆菌，是在大肠杆菌，是dnaGdnaG基因的表达产物。基因的表达产物。引物（引物（primer）：）：DNADNA聚合酶不能从头合成一条新的聚合酶不能从头合成一条新的DNADNA链，而必须有一链，而必须有一段段RNARNA引物（十多个至数十个核苷酸不等），作为引物（十多个至数十个核苷酸不等），作为DNADNA复制的起始点，引物的复制的起始点，引物的3-OH3-OH，必须是游离的。，必须是游离的。 引物酶与经典的引物酶与经典的RNA聚合酶不同，对聚合酶不同，对利福平利福平不敏感。不敏感。引物酶单独存在时相当稳定，只有在与有关蛋白质组引物酶单独存在时相当稳定，只有在与有关蛋白质组成复合体时才有活性，该复合体称为成复合体时才有活性，该复合体称为引发体引发体。（6）DNA连接酶（连接酶（ligase）连接双链连接双链DNADNA中一条链上中一条链上3 3 -OH-OH末端和相邻碱基末端和相邻碱基5 5 -P-P末端，使二者生成末端，使二者生成磷酸二酯键磷酸二酯键，从而把两段相，从而把两段相邻的邻的DNADNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。POO-O-OHO5POO-O-O335DNA连接酶连接酶ATP（NAD+）AMP5353 在复制中起接合在复制中起接合双链中单链缺口双链中单链缺口的作用；的作用； 在在DNADNA修复、重组中也起缝合缺口作用；修复、重组中也起缝合缺口作用； 是基因工程的重要工具酶之一。是基因工程的重要工具酶之一。DNA连接酶的功能连接酶的功能（7）DNA解旋酶解旋酶(helicase) 位于复制叉前，位于复制叉前，利用利用ATPATP供能供能，作用于氢键作用于氢键，使，使DNADNA双链双链解开成为两条解开成为两条单链单链，便于，便于DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII和引物酶作用。和引物酶作用。 每解开一对碱基，需消耗每解开一对碱基，需消耗2 2分子分子ATPATP。解链方向解链方向解解旋旋酶酶 （8） 单链结合蛋白单链结合蛋白 (single strand binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保护在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整性（不被核酸酶降解）单链的完整性（不被核酸酶降解）。SSB（9）DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 (topoisomerase) （9）DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 (topoisomerase) 拓扑异构酶作用特点拓扑异构酶作用特点兼有兼有内切酶活性内切酶活性和和连接酶活性连接酶活性克服解链过程中的打结、缠绕现象。克服解链过程中的打结、缠绕现象。拓扑异构酶拓扑异构酶：每次通过断裂和连接双链每次通过断裂和连接双链DNA中中的一条链而改变的一条链而改变DNA的拓扑异构（超螺旋）。的拓扑异构（超螺旋）。拓扑异构酶拓扑异构酶：每次通过断裂和连接两条每次通过断裂和连接两条DNA链而链而改变改变DNA的拓扑异构（超螺旋）。的拓扑异构（超螺旋）。（一）复制的起始（一）复制的起始需要解决三个问题：需要解决三个问题： 复制起始位点的识别；复制起始位点的识别； DNADNA解开成单链，提供模板；解开成单链，提供模板； 合成引物，提供合成引物，提供3 3 -OH-OH末端。末端。三、原核生物的三、原核生物的DNA生物合成生物合成 DNADNA的复制可以分为的复制可以分为3 3个阶段：个阶段：起始、延伸起始、延伸和和终止终止。DNADNA复制只能从复制只能从DNADNA分子的特定分子的特定区域内区域内开始，开始，此部位称此部位称复制起始点复制起始点（origin of replication, ori）。DNADNA复制从起始点开始到终点结束，复制从起始点开始到终点结束，DNADNA上每个独立复上每个独立复制单位称为制单位称为复制子复制子。原核生物每个原核生物每个DNADNA分子只有一个复制起始点，因而只分子只有一个复制起始点，因而只有有一个复制子一个复制子；真核生物的每个；真核生物的每个DNADNA分子有多个复制分子有多个复制起始点，故含有起始点，故含有多个复制子多个复制子。 大肠杆菌复制起始点大肠杆菌复制起始点oriC的的结构结构245bp复复制制的的起起始始过过程程DnaA蛋白与蛋白与oriC的的9核苷酸重复序列结合并打开核苷酸重复序列结合并打开13核苷酸核苷酸保守序列形成单链保守序列形成单链DNA解旋酶解旋酶( (DnaBDnaB蛋白蛋白) )被运送到复被运送到复制模板，与模板结合制模板，与模板结合解旋酶解旋酶( (DnaBDnaB) )作用于氢键，消作用于氢键，消耗耗ATPATP，解开双螺旋变成单链，解开双螺旋变成单链单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白(SSB)(SSB)与单链与单链DNADNA结合，避免重新配对和降解结合，避免重新配对和降解引物酶（引物酶（DnaGDnaG）催化合成最初的）催化合成最初的RNARNA引物引物DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII在在RNARNA引物引物3-OH3-OH端添加端添加dNMPdNMP，合成新链，合成新链3 5 3 5 引物引物3 HO5引物引物酶酶DNA拓扑异构酶拓扑异构酶解旋酶解旋酶SSB复制叉复制叉（二）复制的延伸（二）复制的延伸复制的延伸指在复制的延伸指在DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII催化下，催化下，dNTPdNTP以以dNMPdNMP的方式逐个加入到引物或新和成的子链的方式逐个加入到引物或新和成的子链上，其上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成化学本质是磷酸二酯键的不断生成。 前导链前导链后随链后随链复复制制过过程程简简图图 顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的这顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的这股链称为股链称为前导链前导链 (leading strand)。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为为后随链后随链 (lagging strand)。 前导链连续复制而后随链不连续复制，就是复制前导链连续复制而后随链不连续复制，就是复制的的半不连续性半不连续性。 冈崎片段冈崎片段(Okazaki fragment)(Okazaki fragment)： 1968 1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到自显影技术，观察到DNADNA复制中出现一些复制中出现一些不连续的片段不连续的片段，将这些不连续的片段称，将这些不连续的片段称为为冈崎片段冈崎片段。冈崎片段再由。冈崎片段再由DNADNA连接酶连连接酶连成一条完整的新链。成一条完整的新链。 原核生物原核生物: : 1000-20001000-2000个核苷酸个核苷酸 真核生物真核生物: : 100-200100-200个核苷酸个核苷酸3 5 3 5 3 5 3 5 解链方向解链方向前导链前导链(leading strand)后随链后随链(lagging strand)复制的半不连续性复制的半不连续性3 5 冈崎片段冈崎片段前导链前导链后随链后随链复制叉上的一个复制叉上的一个聚合聚合酶分子酶分子如何实现两条链的同如何实现两条链的同时合成？时合成？DNA聚合酶聚合酶IDNA连接酶连接酶后随链上不连续性片段的连接后随链上不连续性片段的连接1.1.去除去除RNARNA引物引物 2.2.填补缺口填补缺口 3.3.连接切口连接切口5 5 3 3 5 5 OH P3 3 5 5 3 3 （三）复制的终止（三）复制的终止(Termination)oriterTus 定点起始（定点起始（OriC），）， 两个复制叉双向等速进行，两个复制叉双向等速进行， Ter 终止，半保留、半不连终止，半保留、半不连续复制。续复制。（四）、原核生物复制的特点（四）、原核生物复制的特点oriCTer DNADNA聚合酶能区分聚合酶能区分NTPNTP与与dNTPdNTP； DNADNA复制时按照复制时按照碱基配对规律碱基配对规律进行，是遗传信息能准确进行，是遗传信息能准确传代的基本前提；传代的基本前提； DNADNA聚合酶具有聚合酶具有3-53-5核酸外切酶活性和即时校对功能核酸外切酶活性和即时校对功能，可以检测并消除偶然出现的错误。可以检测并消除偶然出现的错误。 RNARNA引物引物也是保证复制忠实性的因素。也是保证复制忠实性的因素。 细胞内具有完整的细胞内具有完整的DNADNA修复机制修复机制，可以校正、修复新合，可以校正、修复新合成成DNADNA中的碱基错误及中的碱基错误及DNADNA损伤。损伤。（五）、（五）、DNA复制高保真性的酶学机制复制高保真性的酶学机制 DNA复制的出错率仅为复制的出错率仅为10-10 -10-9左右。左右。复制的特点复制的特点四、真核生物的四、真核生物的DNA生物合成生物合成 半保留、半不连续复制；半保留、半不连续复制； 多起点复制，多复制子冈崎片段长度多起点复制，多复制子冈崎片段长度100100200 200 ntnt； DNA DNA复制的同时，组装成新的核小体。复制的同时，组装成新的核小体。 oriorioriorioriori五、反转录五、反转录以以RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA的过程称为的过程称为反转录反转录(reverse (reverse transcription),transcription),催化这一反应的酶称为催化这一反应的酶称为反转录酶反转录酶。反转录酶也需要引物。反转录酶也需要引物。依赖依赖RNA的的DNA聚合酶聚合酶核糖核酸核糖核酸酶酶H依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶六、六、DNADNA的损伤、修复与突变的损伤、修复与突变（一）（一）DNA损伤损伤 (DNA damage)： 泛指一切泛指一切DNA结构和功能的变化结构和功能的变化。包括各种突。包括各种突变、碱基的损伤和变、碱基的损伤和DNA链的断裂。链的断裂。引发引发DNA损伤的因素损伤的因素 自发性自发性: 自然错配率约为自然错配率约为1010-9-91010-10-10 左右。左右。 物理因素物理因素: 如如UV 、各种辐射。、各种辐射。 化学因素化学因素: 烷化剂、碱基类似物、以及其他一些烷化剂、碱基类似物、以及其他一些人工合成或环境中存在的化学物质，这些诱发人工合成或环境中存在的化学物质，这些诱发突变的化学物质突变的化学物质, ,称为致癌剂。称为致癌剂。 生物因素生物因素: 抗菌素类、黄曲霉素和病毒等。抗菌素类、黄曲霉素和病毒等。紫外照射时紫外照射时DNA链中相邻嘧啶形成二聚体。链中相邻嘧啶形成二聚体。（二）（二）DNA突变突变DNA分子中分子中碱基序列改变碱基序列改变，从而导致，从而导致DNA的的复制及后来的转录和翻译随之发生变化。复制及后来的转录和翻译随之发生变化。DNA突变分为突变分为自发突变自发突变和和诱发突变诱发突变。突变类型：突变类型：1. 置换：置换：一个或几个碱基的替换，又称点突变。 转换：转换：PyPy被被PyPy替换或者替换或者PuPu被被PuPu替换；替换； 颠换：颠换：PyPy被被PuPu替换或者替换或者PuPu被被PyPy替换。替换。2. 插入：插入：DNA链中插入一个或几个碱基；3. 缺失：缺失： DNA链中缺失一个或几个碱基。转换转换插入插入缺失缺失野生型基因野生型基因 -T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C- -T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-颠换颠换 -T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C- -T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C- -T-C-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-AT（三）修复（三）修复1. 光裂合酶修复光裂合酶修复：经光照射后，光裂合酶修复嘧啶二聚体。2. 切除修复切除修复：主要修复机制，在一系列酶作用下切除受损伤部分，以完整的一条链为模板，合成出切去的部分，使DNA恢复正常结构。3. 重组修复重组修复：受损伤部位DNA复制后留下缺口，在重组酶的作用下，带缺口的DNA与完整的姐妹染色单体的双链DNA进行重组交换。切除修复动画切除修复动画以单链以单链DNA为模板，为模板，NTP为原料，在为原料，在RNA聚合酶催化聚合酶催化下合成下合成RNA的过程。的过程。转录仅以转录仅以DNA一条链的某一区段为模板，这种转录方式一条链的某一区段为模板，这种转录方式称为称为不对称转录不对称转录。双链双链DNA分子中分子中作为模板转录出作为模板转录出RNA的那条链，称为的那条链，称为模板链模板链（反义链，负链反义链，负链）； 另一条链称为另一条链称为编码链编码链（有义链、正链有义链、正链）。三、三、RNA聚合酶：聚合酶： 核心酶核心酶全酶全酶 起始因子，带领核起始因子，带领核心酶识别启动子心酶识别启动子与与DNA模板结合模板结合聚合酶活性聚合酶活性结合启动子及聚结合启动子及聚合酶其余组分合酶其余组分原核生物只有一种原核生物只有一种RNA聚合酶。聚合酶。四、转录过程：四、转录过程： 转录过程分为转录过程分为起始起始、延伸延伸和和终止终止三个阶段：三个阶段： 1. 起始：起始：基因上由基因上由RNA聚合酶识别、结合并确定转录起始位点聚合酶识别、结合并确定转录起始位点的特殊的特殊DNA序列称为序列称为启动子启动子。-153AATTGCCTG ACGTTT*GACCGT+1编码链编码链53TTAACGGAC TGCAAA*CTGGCA模板链模板链ACGUUU*GACCGU-10区区富含富含AT，又称为，又称为TATA box 或或 Pribnow box，有，有助于助于DNA双螺旋的局部解链；双螺旋的局部解链；-35区区与转录起始的辨认有关，并决定启动子的强度。与转录起始的辨认有关，并决定启动子的强度。 RNA聚合酶全酶识别聚合酶全酶识别-35区，区，并与启动子结合；并与启动子结合； 在在亚基作用下从亚基作用下从-10区开始解区开始解链，在链，在DNA链上形成链上形成转录泡转录泡； 加入第一个加入第一个NTP启动启动RNA合成。合成。RNA的合成不需要引物的合成不需要引物。转录起始过程：转录起始过程： 2. 延伸：延伸：形成启动子形成启动子-全酶全酶-NTP三元三元复合物后，新的复合物后，新的NTP加入，加入，形成形成磷酸二脂键磷酸二脂键。聚合几个核苷酸后，聚合几个核苷酸后， 亚基亚基从全酶上解离。从全酶上解离。核心酶沿模板链核心酶沿模板链35的方向移动，按照碱基的方向移动，按照碱基配对的原则以配对的原则以53方向合成方向合成RNA链。链。E.ColiE.Coli RNA RNA聚合酶以聚合酶以4545个核苷酸个核苷酸/ /秒的速度合成秒的速度合成RNARNA。RNARNA聚合酶缺乏核酸外切酶活性，不具备校对功能。聚合酶缺乏核酸外切酶活性，不具备校对功能。 3. 终止：终止：基因末端终止转录的一段特殊基因末端终止转录的一段特殊DNA序列称为序列称为终止子终止子。不依赖不依赖-因子的终止子因子的终止子 特点：在转录终点前有一段特点：在转录终点前有一段富含富含G-C的回文序列的回文序列，其下，其下游有游有68个个T。终止子序列被转录后回文序列形成。终止子序列被转录后回文序列形成发夹发夹结构结构，使聚合酶减慢或暂停，使聚合酶减慢或暂停RNA合成。发夹结构之后转合成。发夹结构之后转录出一系列录出一系列U，RNA-DNA杂交链中的杂交链中的U-A碱基配对结构碱基配对结构不稳定，极易被破坏，导致不稳定，极易被破坏，导致RNA-DNA杂交链在终止区杂交链在终止区解链，解链，RNA聚合酶脱离模板，使转录终止。聚合酶脱离模板，使转录终止。依赖依赖-因子的终止子因子的终止子 特点：含回文序列，转录后也形成发夹结构，但其中特点：含回文序列，转录后也形成发夹结构，但其中G-C序列少，发夹结构后也缺乏一系列的序列少，发夹结构后也缺乏一系列的U，需要，需要因子因子的帮助才能终止的帮助才能终止RNA的合成。聚合酶在终止子暂停，的合成。聚合酶在终止子暂停，因因子借助水解子借助水解ATP供能，追上聚合酶并利用解旋酶活性使供能，追上聚合酶并利用解旋酶活性使RNA-DNA解链，转录停止。解链，转录停止。 因子因子 六个亚基组成的蛋白质；六个亚基组成的蛋白质； 具有具有ATP酶活性；酶活性； 具有具有DNA-RNA解旋酶活性。解旋酶活性。五、五、RNA转录加工：转录加工： 原核生物原核生物mRNA可可直接作为翻译的模板，一般直接作为翻译的模板，一般不进行转录后加工；而不进行转录后加工；而rRNA、tRNA原初转录原初转录产物均为无功能的前体，必须经过加工、修饰产物均为无功能的前体，必须经过加工、修饰才能成为有功能的分子。才能成为有功能的分子。转录后加工包括切除某些核苷酸序列、拼接、转录后加工包括切除某些核苷酸序列、拼接、形成形成5和和3端的特殊结构、碱基修饰、改变糖端的特殊结构、碱基修饰、改变糖苷键等过程。苷键等过程。1、原核生物中原核生物中rRNA前体的加工前体的加工2、tRNA前体分子的加工前体分子的加工E.Coli 有有60种种tRNA, 少数随少数随rRNA 一起一起转录，其余成簇排列，转录成含有两个转录，其余成簇排列，转录成含有两个或多个或多个tRNA的前体。的前体。其加工过程包括：其加工过程包括：切除切除tRNA前体两端多余的序列；前体两端多余的序列； 3端添加端添加CCA； 对碱基进行特殊修饰。对碱基进行特殊修饰。酵母酪氨酸酵母酪氨酸tRNA前体的加工前体的加工六、真核生物中的转录：六、真核生物中的转录： 1、转录与翻译场所不同、转录与翻译场所不同真核生物的转录比原核生物复杂，主要特征：真核生物的转录比原核生物复杂，主要特征：原核生物中原核生物中mRNA的转录与翻译几乎同时进行，而真的转录与翻译几乎同时进行，而真核生物转录发生在细胞核内，翻译发生在细胞质中。核生物转录发生在细胞核内，翻译发生在细胞质中。2、RNA聚合酶不同聚合酶不同原核生物只有一种原核生物只有一种RNA 聚合酶，而真核生物至少有聚合酶，而真核生物至少有三种三种RNA聚合酶。聚合酶。 : rRNA (5.8S, 18S, 28S)； : mRNA, microRNA，对，对-鹅膏蕈碱鹅膏蕈碱高度敏感；高度敏感； : tRNA, 5sRNA； : siRNA (植物中植物中) 。类鬼笔鹅膏类鬼笔鹅膏3、启动子不同、启动子不同真核生物中不同真核生物中不同RNA聚合酶分别有自己的启动子。聚合酶分别有自己的启动子。许多许多RNA聚合酶聚合酶识别的启动子在识别的启动子在-25区有区有TATA box。另外，真核生物启动子序列含有许多种类、数量和位置另外，真核生物启动子序列含有许多种类、数量和位置不同的核酸保守序列（不同的核酸保守序列（顺式作用元件，顺式作用元件，cis-element），），决定了基因的表达特征决定了基因的表达特征。4、转录后、转录后RNA加工修饰不同加工修饰不同真核生物真核生物rRNA及及tRNA的转录加工与原核生物类似。的转录加工与原核生物类似。真核生物真核生物mRNA以单个基因为转录单位，转录成以单个基因为转录单位，转录成单顺单顺反子反子mRNA。多数基因是不连续的，编码序列（多数基因是不连续的，编码序列（外显子外显子，extron）被非编码序列（被非编码序列（内含子内含子，intron）分割成若干片段，）分割成若干片段，称为称为断裂基因断裂基因。UTRUTR，untranslateduntranslated region region，非翻译区，非翻译区编码序列（外显子）编码序列（外显子）非编码序列（内含子）非编码序列（内含子）53外显子和内含子一起被转录生成外显子和内含子一起被转录生成mRNA前体分子，在前体分子，在核内加工形成大小不等的中间物，称为核内加工形成大小不等的中间物，称为核不均一核不均一RNA (hnRNA，heterogeneous nuclear RNA)。hnRNA的加工：的加工：1. 转录完成之前在转录完成之前在5端加端加帽子结构帽子结构(m7G5ppp5Np-)；2. 在在3末端添加末端添加多聚腺苷酸多聚腺苷酸（poly A，150-250）尾巴；）尾巴；3. 剪去内含子，拼接外显子；剪去内含子，拼接外显子；4. 链内特定核苷酸的甲基化（链内特定核苷酸的甲基化（m6A）。）。 UTRUTR，untranslateduntranslated region region，非翻译区，非翻译区编码序列（外显子）编码序列（外显子）非编码序列（内含子）非编码序列（内含子）CAPAAAAAAAAACAPAAAAAAAAA成熟的成熟的mRNA1. 核苷酸合成抑制剂核苷酸合成抑制剂核苷酸合成代谢底物或中间产物的结构类似物。核苷酸合成代谢底物或中间产物的结构类似物。 氨基酸类似物氨基酸类似物：Gln重氮乙酰丝氨酸等；重氮乙酰丝氨酸等； 叶酸类似物叶酸类似物： FH4氨基蝶呤等；氨基蝶呤等； 碱基和核苷类似物碱基和核苷类似物： 6巯基嘌呤等。巯基嘌呤等。七、核酸合成抑制剂：七、核酸合成抑制剂：2. 与与DNA模板结合的抑制剂模板结合的抑制剂与与DNA结合，使结合，使DNA失去模板功能，抑制复制及转录。失去模板功能，抑制复制及转录。（1）嵌合剂）嵌合剂：放线菌素：放线菌素D、溴化乙锭等。、溴化乙锭等。（2）烷化剂）烷化剂：氮芥：氮芥(C5H11Cl2N)；硫芥；硫芥(C4H8Cl2S)。芥子气毒气弹芥子气毒气弹 2. 作用于聚合酶的抑制剂作用于聚合酶的抑制剂 此类抑制剂直接作用于此类抑制剂直接作用于DNA聚合酶或聚合酶或RNA聚合酶。聚合酶。如：如：利福平利福平（结合（结合RNA聚合酶聚合酶亚基，阻断转录启动）；亚基，阻断转录启动）； 曲张霉素曲张霉素（阻断（阻断RNA链延伸）；链延伸）； 膦羧基乙酸膦羧基乙酸 （抑制（抑制DNA聚合酶）。聚合酶）。基因工程基因工程（遗传工程）是在分子水平上利用人工方法（遗传工程）是在分子水平上利用人工方法对对DNADNA进行重组的技术。进行重组的技术。利用酶学方法，将异源基因与载体利用酶学方法，将异源基因与载体DNADNA在体外进行重组在体外进行重组，再将它送入另一生物的活细胞中，使异源基因在其，再将它送入另一生物的活细胞中，使异源基因在其中复制和表达，从而达到改造其性状或者大量生产人中复制和表达，从而达到改造其性状或者大量生产人类所需产物的目的。类所需产物的目的。基因工程操作技术：基因工程操作技术：包括两个紧密相关的环节：包括两个紧密相关的环节：1. 体外基因重组体外基因重组2. 重组体的转化、增殖与表达重组体的转化、增殖与表达（1）目的基因制备：）目的基因制备：聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）是）是具有高选择性、高灵敏度和快速的具有高选择性、高灵敏度和快速的DNA片段扩增技术。片段扩增技术。PCR过程类似于过程类似于DNA复制，需要哪些因子？复制，需要哪些因子？DNA模板、模板、DNA聚合酶、引物、聚合酶、引物、dNTP、缓冲液、缓冲液、合适的温度。合适的温度。PCRPCR技技术术原原理理示示意意图图变性（变性（94，30S）Taq酶酶退火（退火（50，30S）DNA引物引物（18-30 nt）延伸（延伸（72 ，1min ）DNA模板模板cycles35变性变性94C延伸延伸72C退火退火Tm-5C（2）基因载体）基因载体 (vector)： 有合适的限制性内切酶切割位点、有合适的限制性内切酶切割位点、 有筛选标记、在受有筛选标记、在受体细胞中独立复制且连接一段较长额异源体细胞中独立复制且连接一段较长额异源DNA后仍具后仍具备自我增殖能力、拷贝数多、易分离。备自我增殖能力、拷贝数多、易分离。最常用的载体有最常用的载体有质粒质粒和和噬菌体噬菌体。质粒质粒是细菌和酵母中独立于染色体之外能自主进是细菌和酵母中独立于染色体之外能自主进行复制的双链环状行复制的双链环状DNA分子。分子。噬菌体噬菌体是细菌病毒，能独立复制并稳定遗传。是细菌病毒，能独立复制并稳定遗传。（3）目的基因与载体重组）目的基因与载体重组根据目的基因的大小和不同用途，选择合适的载体，根据目的基因的大小和不同用途，选择合适的载体，在在DNA连接酶作用下，将目的基因与载体连接酶作用下，将目的基因与载体DNA连接构连接构成重组体。成重组体。+DNA ligase2. 重组体的转化、增殖与表达重组体的转化、增殖与表达(1) 转化转化：将重组：将重组DNA导入受体细胞；导入受体细胞；(2) 筛选筛选：从转化后的受体细胞中筛选出含有重组体：从转化后的受体细胞中筛选出含有重组体 的细胞；的细胞；(3) 增殖和基因表达增殖和基因表达：将筛选出的转化细胞在适当的：将筛选出的转化细胞在适当的 培养条件下大量繁殖，使重组培养条件下大量繁殖，使重组DNA在受体细胞在受体细胞 中的拷贝数大大增加，产生目的基因产物。中的拷贝数大大增加，产生目的基因产物。转化转化筛选筛选增殖与表达增殖与表达The End