CAT酶活性测定.doc

植物组织中过氧化氢酶的活性测定紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。【仪器与用具】 紫外分光光度计；冷冻离心机；研钵；容量瓶；刻度吸管；恒温水浴；分析天平【试剂】1. 0.05mol/L pH7.0磷酸缓冲液2. 0.2mol/L H2O2溶液：30% H2O2 11.36ml溶于磷酸缓冲液中，定量至250ml。3.0.05 mol/LTris-Hcl缓冲液（pH7.0）【材料】正常生长或经逆境处理的新鲜植物组织【方法步骤】 1.酶液提取：称取剪碎混匀的植物样品（如叶片等）1.00g置与预冷的研钵中，加入适量预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂冰浴研磨成匀浆后，转入10ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到10ml。取提取液5ml于离心管中，在4、15000g下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。4下保存备用。2.CAT活性测定（1）取10ml具塞试管，加2ml酶提取液于沸水浴中加热煮死，冷却备用。（2）取10ml具塞试管，3支为测定管（3个重复），1支为对照，按下表加入试剂：表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表管 号S1S2S3S4Tris-Hcl1.01.01.01.0粗酶液(ml)0.10.10.10.1(煮死酶液)蒸馏水(ml)1.7(4)1.7(4)1.7(4)1.7(4) 将上述4支试管于25水浴中预热3min后,逐管加入0.2ml 0.2mol/L的H2O2溶液，每加完一管立即在紫外分光光度计上测定A240（蒸馏水调零），每隔30s读数一次，共测3min,记录4支试管的测定值。（需用石英比色杯） 3.结果计算： 以1min内A240降低0.1（三支测定管的平均值）的酶量为1个酶活单位（u），先求出3支测定管各自1min内A240降低值，按下式计算CAT活性。 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=式中 A240 = AS0(+As3)AASS123+ AS0加入煮死酶液的对照管吸光值； AS1, AS2,As3样品测定管吸光值； Vt酶提取液总体积（ml）； V1测定时用酶液体积（ml）； FW样品鲜重（g）； 0.1A240每下降0.1为1个酶活单位（u）； t加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。 【注意事项】 凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。【思考题】 1.影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?2氧 氢关有生活与酶些些素紫测外酶化收影题扰干验对收有 】意 ） 时后氢氧加 ） 活个 降每 0 ）品 ）积液测 ） 体取 值吸测 值吸对液入 ) ( 具与性活氢过即度的量测降时反) 吸溶使氧过酶氧吸有波 在 理= 外 ) 光 性活冷化 离性性 ；计，降； 自定； 先度 （酶；量）均管浴测.降析 天内 ：计. 杯比用。测管 ，一0每零馏0 上光分即一加液 的 .加逐 热中水管支述 ( ( (液煮. . 置配 测外 -剂剂表照为，个（定 管 取用备冷煮浴液酶 管具 取测测用存下 酶氧为上 下0 、中离 取取 容并洗合钵冲缓，瓶 后浆研砂少液磷 量加钵冷与0 叶如植混取：液 】步组组鲜理经长料0 缓 0至，冲缓于 液 冲酸0 0剂