WB实验基本步骤.doc

实验基本步骤提取细胞蛋白BCA定量制备蛋白胶（SDS-PAGE胶）蛋白样品变性电泳转膜封闭一抗TBST洗涤二抗TBST洗涤显影结果分析9照拍扫进，上。响果会否伤不指一片尽片动：上朝，在意，影显反来镊将面影于显适 合混等保在两二0 : 白 二0 参 二00: 二一镊， （，纸头，0（移，品显 每次洗脱室 用后孵室触并释备方  ，四摇下在 ， 过者育，的对入标切位所的钟分每 闭动床脱室平闭封膜 ，一，反疫免液闭准备膜。的膜就的没水然摇床脱 染丽用将  一红对面，黑面使）中浆产时（中放将。流空门室套手时甲移。生后接接不滤两气的断行移转个子可就垫个上后泡并张上膜泡动移后膜整盖上膜泡气用，纸与调用标好上胶下小刮分免）操缩去轻浓后板小。很，定撬板去，松开玻撬撬的边在要动候撬才掉玻泡气其棒用定一，于起在张（纸上在动便不使住一擀。的走几来用垫一垫平水的开子将 少衡液入将，透湿甲 中电绵块子用入盘的转膜染白上因用手戴时滤冰冰转） 0 ，镊）配转转液电好（膜，止可刚酚至压0增离跑溴，始 。污免，涤冲泳在样时样一加样可也，加品使太。样缓样插针样。进出将样吸液。 。漏意璃短过少至。面字板块要另那一若。璃，面玻。电足中泳入 将装电冰 ，（移 胶蛋） 泳电 作器意变全使 0在样。样0限最样 不般样（为浓 冲样 入管 . 样取入算加的 / 用样后蛋测的 上每品稀 枪， 处处备保中次一量加下洗， 0，气有注子灌酒吸用，掉缩表泡有意 0，封，离分配 板璃藏箱 酰聚）现冻 梳璃好前可%  泳 .0 浓 （ 量序样线准倍 了已量注白存保,是,个:标用 >。曲作为光坐为（含,后吸样准录定比 吸中 震微在后分0下 在 误减加上,平工好 到 溶孔，品准之区号 , ，按着，的（板加的溶 0液标的/ 液溶 配 释液准的 ， 一，要复三做 即 + （品0孔） 0倍 定数定稀 0液 0 ， 些般 液， 液 每总数用好孔围（个做分，区孔准 ， 作 ） ， 0（液孔量定（的白蛋存中心的 0分清心 于完动摇经瓶裂胞为， 解于，解 0中。合解可结至 （冰， 0（ 0加 液培洗两洗次上重上后 心0后悬轻枪） . 0 冷 养去，细出取冰预 心冷个 .） 0 移）0 冷 ，制样实预， =封奶% 闭 .水 0+0-温. 纯 液 ， 预箱 ， 溶溶 转 .0 0 %00 灭蒸, .= ，0 0 二 . 液盐 配 盐 二 0= 00. ， -+. 闭= ，样 ）0 冷 取去冷0.）后 上上两 （冰 结解 解，裂摇 分0心存的孔（，） 区做围好总 ，液些， 稀定0孔品+ 三， 的释 溶/液 加的按, 号准孔 ,加在0后微 定吸（为为 ,是注量准序 .  %梳 ）藏板分，有缩吸子有 下量处， 测样/ 入取 管样 样限0在 全作电）蛋， 装 泳。，。一要。过短 。将样插缓品也加一样涤。始跑0至可（好配镊 ）冰滤因白的盘绵电湿，衡 将水一来。住不在张于定棒玻才要的玻开撬很小轻缩免小好调，用盖膜泡膜后上就转的滤接生移室空放时产面面一 丽 摇然就膜闭免一 封平动 每的标的育 摇四方并孵用脱每显移0，二 0 :二保合显将反影朝动尽指会果进照 分显洗洗二洗 一封转电变变胶 - 胶定蛋胞试剂配制1.PBS磷酸盐缓冲溶液1L磷酸二氢钾 0.24g磷酸氢二钠 1.44g氯化钠 8g氯化钾 0.2g加入500ml纯水，调PH=7.2定容至1L,高压蒸汽灭菌2.PBST（PBS+0.05%吐温-20）500mlPBS+0.25ml吐温-203.电转液500mlTris 1.5g甘氨酸 7.2g400ml水溶解加入100ml甲醇，置于4冰箱预冷4.电泳液（1X）10x稀释，50ml10x电泳液+450ml纯水5.TBS6.TBST（TBS+0.05%吐温-20）50mlTBS+450ml纯水+0.25ml吐温-207.封闭液TBST1X+5%奶粉40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉，40预热WB实验一、蛋白样品制备准备:一管细胞，PBS（4预冷），PMSF（100mM），移液枪（1000ul，10ul），1.5mlEP管2个，高速冷冻离心机4预冷1. 于-20冰箱中取出一管细胞样品，吸去培养液2. 加入1ml 4预冷的PBS（0.01M pH7.27.3）。用移液枪轻轻吹成悬浮液后4，8000r离心5min，然后弃去上清。重复以上操作一次，共洗细胞两次以洗去培养液。3.按1ml裂解液加10 l PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4.在样品中加入300ul含PMSF的裂解液，吹匀，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5.裂解完后，于4下12000 rpm离心5 min。7.将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于20保存。二、 蛋白含量的测定（BCA定量）准备：96孔板，移液枪（1000ul，10ul，200ul），BCA工作液（A+B），50mlEP管，1xPBS，BSA标准液1. 将96孔板分好区域，若不够分则只做两个重复，（外围一圈的孔最好不用）2. 算好孔数（总的）每孔加200ulBCA工作液（A+B），（A液：B液=50:1，一般配多些，如60孔，A液12000ul，B液240ul）3. 将样品稀释到一定倍数才能定量，（10倍，20倍，30倍），每孔需要20ul样品（2ul样品+18ulPBS,即稀释10倍），做三个重复则需要60ul，一般配80ul4. 配蛋白标准样品，将2mg/ml的蛋白标准溶液稀释至0.5mg/ml，若配200ul 的0.5mg/ml蛋白标准溶液则需要50ul的2mg/ml的蛋白标准溶液和150ul PBS溶液5. 将稀释好的样品加入孔板中（标记的区域），接着标准品按0，1,2,4,8,12,16,20ul加到标号的区域，之后在加标准样品的孔内，将孔内溶液用PBS补足到20ul6. 每孔加200ul配好的工作液,平行加,不能上下加,以减少误差7. 将加好的96孔板放在37下孵育30分钟8. 孵育完后,放在酶标仪轻微震荡3-10s,中速,吸光值595nm,进行比色测定,记录标准曲线及样品吸光值数据后,以蛋白含量（ml）为横坐标,吸光值为纵坐标作标准曲线。（R2 >0.98才有用,酶标仪操作:两个箭头图标,1是结果,2是保存）9. 计算蛋白含量（注意定量样品已经稀释了10倍）蛋白质定量标准曲线加样量序号12345678标准蛋白量/ul （0.5mg/ml）01248121620背景液（PBS）/ul2019181612840标准液浓度mg/ml00.0250.050.10.20.30.40.5三、SDSPAGE电泳 1.  配胶（12%,可以提前配好）准备：玻璃板，梳子，AP（解冻，现拿现用），聚丙烯酰胺（4冰箱冷藏）（1）玻璃板验漏5min（2）按表配置分离胶（3）灌胶，加酒精封压，凝30min（注意不要有气泡）（4）按表配浓缩胶，倒掉酒精，用吸水纸吸去酒精，灌胶，插梳子（注意不要有气泡），凝30min（5）取胶，用水冲洗一下浓缩胶，加少量水放入一次性手套中4冰箱保存备用2. 样品处理准备：PBS，移液枪，1.5mlEP管（1）稀释样品：一般每孔上样5ul，即1mg/ml浓度的样品，测完蛋白含量后，将样品用PBS稀释至1mg/ml（注意loadingbuffer的加入也得算入）（2）取出上样样品15ul至1.5 ml离心管中，加入6×SDS 上样缓冲液3ul至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15 l，加样孔的最大限度可加20 l样品。）（3）将样品在100煮5 min震荡使蛋白完全变性（注意仪器操作）3.   电泳准备：电泳液500ml（现配），蛋白胶，10ul移液枪（枪头），样品，Marker，冰盒，电泳装置（1）将SDS-PAGE胶放入电泳槽中，加足够的电泳液。（短玻璃板面向内，长玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。电泳液至少要漫过内测的短玻璃板。注意先检漏。）（2） 上样。用移液枪贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。）（3）先设置80V，开始电泳，样品溴酚蓝跑至分离胶后增至120V电压，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。（此时准备好电转液）四、转膜准备：电转液（现配4冰箱冷藏），镊子，滤纸，PVDF膜（0.45um），电转装置，冰盒注意：拿滤纸和膜时一定要戴手套或用镊子，因为手上的蛋白会污染膜。1.   在加有转移液的盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫2. 滤纸浸入电转液中，PVDF膜在甲醇中润湿成半透明，小心将膜放入4电转液中平衡至少5min。3.   将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。4. 先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上（做好标记），用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）5.  将夹子放入转移槽中（电转移时会产热，浆槽放入冰中），要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。一般用100mA转移90min。6.  转完后将膜用1×丽春红染液染5 min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。（准备封闭液）六、免疫反应准备：封闭液，一抗，二抗，TBST1 .  将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。2.   TBST洗4次。每次5分钟。3. 将膜按照目的蛋白所处位置剪切并做好标记，加入相对应的一抗，室温孵育2h或者4过夜4. 室温下孵育12 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗四次，每次5min5.  同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育12 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗4次，每次5 min七、显影准备：样品胶片，移液枪（200ul），中枪头，吸水纸，显影液（A+B），薄镊子一抗二抗目的蛋白78kdBip 1:1000兔二抗75kd目的蛋白34kdGAPDH内参1:5000鼠二抗28kd目的蛋白17kdSep15 1:1000兔二抗1.  将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；2. 1 min后，取适量显影液于显影仪台面上，将膜用镊子夹起来正反面充分和显影液接触，注意切角在左上，即正面朝上。应注意的是：显影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。 3.盖上盖子，将胶片进行扫描或拍照。