乙型肝炎(HBV)核酸扩增（PCR）荧光检测程序.doc

乙型肝炎(HBV)核酸扩增（PCR）荧光检测程序（SOP-HBV）【试剂盒组成】DNA浓缩液（1.4ml/管） 1 管 裂解缓冲液 560ul 1管参比品 (3105 3108copies/ml)10ul 各1管 HBV-PCR反应液 704ul 1管阳性标准品 20ul 1管 临界阳性标准品 20ul 1管阴性标准品 20ul1管 酶溶液 32ul 1管【操作步骤】1. 标本采集、保存和运送 用无菌注射器抽取受检者静脉血1毫升，注入灭菌1.5ml Eppendoff管，于室温静置2小时,8000rpm离心5分钟，吸取200l血清(注意勿带入红细胞)转入另一灭菌1.5ml Eppendoff管，即为血清标本。标本可立即用于测试，也可保存于-20待测，保存期为6个月。标本运送应保持在4以下。2.试剂准备：按标本的数量和所需的对照数量配置反应液。配置：按每个反应取HBV-PCR反应液22ul，酶1ul计算加于一总的无菌离心管中，震荡混匀。分装：用微量加样器在每个PCR反应管内加入23ul上述混匀的反应液，转移到样品处理区，4保存。3. 标本及对照标准品的处理 取50ulDNA浓缩液加入到确定数量的0.5ml离心管中(浓缩液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取), 再分别加入血清标本50l及20ul阴性、临界、阳性对照品，混匀，室温静置2分钟，8000rpm离心5分钟，弃上清。加入10ul裂解缓冲液，剧烈振荡后短暂离心，沸水浴10分钟(误差不超过1分钟), 13,000 rpm离心10分钟, 取上清液2l做PCR反应。4. PCR反应 在Roche LightCycler热循环仪上设定如下程序； 保温40次循环保温372分钟943分钟955秒6040秒375秒 并在PCR循环第二步60时收集荧光信号，收集方式设为“SINGLE”。仪器检测通道选择F1通道；其他为默认值。5.结果判定a、基线设定 用荧光显示模式F1/F2读取结果。基线设定原则以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，且CT值不出现任何数值为准（根据仪器实际情况，一般在0.001-0.1范围内调整）。 B 、阙值设定以刚好高于阴性对照品的扩增曲线最高点，且阴性对照品CT=40或CT=0为原则，调整起始阙值。C、分析 1.由于采用浓缩裂解法，因此所有结果均除以10，即为原始血清病毒浓度。 2.40>CT38的样品，可能因为标本滴度较低而造成漏检，建议重复测定，如果结果仍在此范围则定为阴性，如CT<38则按结果报告。 3.当拷贝数<1000copies/ml时，结果报为HBV-DNA<1000copies/ml。6.试剂质量控制： 临界对照CT<38，阴性对照CT>38,参比品CT的线形相关性<-0.980，此反应视为有效。 注意：如果反应无效，应查找原因，重新检测，直至得到可靠结果为止。