酵母培养实验.doc

酵母培养与酒精发酵实验一、实验目的掌握酵母培养与酒精发酵的基本原理和操作方法，了解影响酵母培养与酒精补料分批发酵的主要因素。二、实验原理本实验综合运用生物工艺学课程中所学的基本原理和发酵方法，对淀粉质原料酒精发酵过程进行全程监测，模拟工业生产上的整个过程，因此是一个综合性很强的实验。要求学生较灵活地运用基本知识，解决实验过程中出现的问题，并在实验后系统总结获得全面提高。麦芽中可供发酵的物质主要是淀粉，而酿酒酵母由于缺乏相应的酶，所以不能直接利用淀粉进行酒精发酵，因此必须对原料进行预处理，通常包括蒸煮（液化）、糖化等处理。蒸煮可使淀粉糊化，并破坏细胞，形成均一的醪液，目前多数厂家开始利用-淀粉酶的液化作用来替代蒸煮过程，这样可大大减少能源消耗。液化后的醪液能更好地接受糖化酶的作用，并转化为可发酵性糖，以便酵母进行酒精发酵。-淀粉酶，又称为1,4-D-葡聚糖葡萄糖水解酶，广泛存在于动、植物和微生物体中，如麦芽或动物的唾液、脾脏中均含有较多的-淀粉酶，而当今-淀粉酶的工业化生产也主要是利用微生物工程菌进行生产的。-淀粉酶容易溶解于水和较稀的缓冲液中，它能够切断淀粉分子中的-1，4糖苷键，生成糊精及少量麦芽糖或葡萄糖，从而使淀粉遇碘变蓝的特异性颜色反应逐渐消失，由此颜色反应消失的速度即可测出该酶的活性。工艺流程如下：麦芽加水拌料液化糖化发酵蒸馏酒精 一级种子 耐高温酒精活性干酵母活化发酵醪中酒精含量的测定方法很多，如常规蒸馏法、碘量滴定法、比色法及改良康维法等，本实验采用第一种方法。三、器材与材料1、酵母菌种，使用前必须活化。2、12oBx麦芽汁培养基3、麦芽汁（见麦芽汁处理），生化培养箱，摇床，离心机，分光光度计，糖份、酒精测定试剂及装置。四、实验步骤及方法1、培养基准备麦芽汁培养基：将干麦芽粉，以200g麦芽加700ml去离子水，加入1g中温-淀粉酶，在65水浴锅中处理3-4h，糖化程度可用碘滴定。将糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用鸡蛋白澄清，方法是将一个鸡蛋白加水约20mL，调匀至生泡沫时为止，然后倒入糖化液中搅拌煮沸后再过滤。将滤液调节至pH约6.4。每组分装后于121，15min，灭菌备用。2、酵母活化3%酵母粉（7.5g），2%葡萄糖（5g），溶解于250ml去离子水中。在35复水20min，降温至32培养2h。3、一级种子培养250mL三角瓶，12oBx麦芽汁培养基，装液量50mL；接活化液约4mL，30，150rpm/min摇瓶培养6-8h。细胞浓度达1.5×108个/mL以上，无杂菌，无死细胞。采用血球计数法进行细菌形态观察和活菌计数，并记录实验结果。在无菌操作台取培养液0.5ml，加入2滴0.05%美蓝染色液，置于装有4.5ml无菌生理盐水的试管中摇匀。无菌操作用移液管滴取菌液于血球计数板中央，放置3分钟后用显微镜观察计数，并且计算出芽率。详见微生物学实验P54。4、乙醇发酵接种：按8%接种量将一级种子分别接入至2只装有100ml麦芽汁培养基的三角瓶中静止培养。其中，一瓶用于测定发酵参数，一瓶始终置于培养箱中培养。补糖：发酵前期，接种4h后补加5%葡萄糖0.2ml，以后每2h补加5%葡萄糖0.2ml至对数生长期后期（具体时间根据菌体生长而定）。发酵中后期，每4h可加入5%左右的葡萄糖2ml。温度：发酵前期30，发酵中后期34。细胞浓度：发酵前期，接种2小时后每小时测定一次细胞浓度至稳定期后，再间隔2小时测一次细胞浓度。用血球记数板法测量菌体量及出芽率，并绘制生长曲线。湿菌体量的计算：发酵结束，离心后，用无菌水洗涤2次，称量湿菌体重。5、蒸馏,测酒精度五、实验数据处理(1)根据实验过程的检测和记录数据，绘制生长曲线。(2)湿菌体重(3)酒精度实验分组及详细安排以3-4人为一组。周一和周二模块3同学分为7组进行培养基和一级种子制备等基础工作，模块1同学进行遗传学实验。周三以后全体同学共同进行酒精发酵实验，共分为18组，其中模块1分为11组，模块3分为7组。在周一和周二模块3同学也需要配制模块1同学实验所需培养基、试剂、一级种子液等。以下列出每天每组的各实验器材及药品准备量。周一上午：分发实验资料，老师讲解。（1）配制麦芽汁培养基（1个250ml三角瓶装液量为50 ml，其余数个（模块3第1-5组6个，6组和7组4个）250ml三角瓶装液量为100 ml，灭菌待用）。（2）同时，每组准备好如下器材： 250ml三角瓶（模块3第1-5组准备7个，6组和7组准备5个）； 1L烧杯（模块3每组准备1个）； 1块血球计数板； 1个盖玻片； 1台显微镜； 5ml移液管8只， 10ml移液管3只； 0.5ml移液管6-7只； 试管30只； 离心管2只。周一下午：（1）干热灭菌：5ml移液管8只，10ml移液管3只，其中5ml移液管和10ml移液管使用时模块1和模块3共18组平分，0.5ml移液管6-7只，试管30只，轮换使用。离心管2支。灭菌待用。（2）酵母活化：以班级为单位制备，由第6组同学完成。3%酵母粉（7.5g），2%葡萄糖（5g），溶解于250ml去离子水中。在35复水20min，降温至32培养2h。然后置于冰箱冷藏。（3）5%葡萄糖溶液：以班级为单位制备，由第7组同学完成。配制5%的葡萄糖液300ml，分3瓶分别置于3只100ml三角瓶中。与麦芽汁培养基一起湿热灭菌。 （4）生理盐水：以班级为单位制备，由第5组同学完成。9g NaCl用去离子水定容至1 L，分装与试剂瓶中。每组将生理盐水分装于30只试管中，每管4.5ml，包扎，与麦芽汁培养基一起湿热灭菌待用。余下未灭菌的生理盐水置于试剂瓶中，室温储藏备用。周二：种子培养。250mL三角瓶，12oBx麦芽汁培养基，装液量50mL；接活化液约4mL，30，150rpm/min摇瓶培养6-8h。细胞浓度达1.5×108个/mL以上，无杂菌，无死细胞。培养至2h后开始取样，以后每小时用血球计数板测定一次细胞量和出芽率。直至对数生长期后期培养结束，将种子液取出置于室温下储藏备用。实验报告要求计算细胞浓度并绘制生长曲线。需及时灭菌生理盐水、移液管等物品。周三：酒精发酵。早6:30需同学先来开紫外灯，7:00所有同学必须到。模块3同学直接接种。模块1同学先在实验室听老师讲解实验内容，而后接种。按8%接种量将一级种子分别接入至2只装有100ml麦芽汁培养基的三角瓶中静止培养。其中，一瓶用于测定发酵参数，一瓶始终置于培养箱中培养。（模块3第6、7两组都接种3瓶，多接的一瓶用于做对照实验）发酵前期，接种4h后补加5%葡萄糖0.2ml，以后每2h补加5%葡萄糖0.2ml至对数生长期后期（具体时间根据菌体生长而定，2瓶都需补糖，但只有一瓶用于测生长曲线）。其中，模块3第6、7两组同时做发酵前期不补糖，发酵中后期照常补糖的对照。对照需测定生长曲线。通过显微镜计数观测到对数生长期后期时即补料5%左右的葡萄糖2ml，以促进酒精生产，并将培养温度升高至34。以后每2h可加入5%左右的葡萄糖2ml至发酵结束。生长曲线的绘制：培养至2h后开始取样，以后每小时用血球计数板测定一次细胞量和出芽率。直至稳定期。至稳定期后，再间隔2小时测一次细胞浓度。以培养时间为横坐标，每毫升菌液所含细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。实际实验时间根据情况而定。周四：离心，取上清液。测酒精度。本实验前请复习以下内容：微生物学实验教材中实验3、4、5、12.老师讲解时会随机提问。实验时请带以下物品：微生物学实验教材；实验讲义；实验数据记录纸；实验报告。生物106实验报告请于12月10日前交至28-204.