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-TUNEL染色-第 3 页TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡实验原理和方法原理：细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 的染色体DNA在Ca ² 和Mg² 依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。实验方法TUNEL检测对于贴壁细胞或细胞涂片a. PBS或HBSS洗涤一次。b. 如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。c. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。d. 用PBS或HBSS洗涤一次。e. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。f. 转步骤5。TUNEL检测对于悬浮细胞或细胞悬液a. 收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。b. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。c. 用PBS或HBSS洗涤一次。d. 用含0.1% Triton X-100的PBS重悬细胞，冰浴孵育2分钟。e. 转步骤5。TUNEL检测对于石蜡切片a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。b.滴加20g/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37作用15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。c. PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。d. 转步骤5。TUNEL检测对于冷冻切片a. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。b. PBS或HBSS洗涤2次，每次10分钟。c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。d. 转步骤5。TUNEL检测配制TUNEL检测液参考下表配制适当量的TUNEL检测液，需充分混匀。注意：配制好的TUNEL检测液必须一次使用完毕，不能冻存。1个样品5个样品10个样品TdT酶2l10l20l荧光标记液48l240l480lTUNEL检测液50l250l500lTUNEL检测对于贴壁细胞、细胞涂片或组织切片a. 用PBS或HBSS洗涤2次。b. 在样品上加50l TUNEL检测液，37避光孵育60分钟。注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少TUNEL检测液的蒸发。c. PBS或HBSS洗涤3次。d. 用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。TUNEL检测对于悬浮细胞或细胞悬液a. 用PBS或HBSS洗涤2次。b. 加入50l TUNEL检测液，37避光孵育60分钟。c. PBS或HBSS洗涤2次。d. 用250-500l PBS或HBSS悬浮。e. 此时可以用流式细胞仪进行检测或涂片后在荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。TUNEL检测常见问题TUNEL检测出现非特异性荧光标记a. 有些细胞或组织，例如平滑肌细胞或组织，nuclease或polymerase的酶活性水平较高，易导致出现非特异性的荧光标记。解决方法是，取细胞或组织后立即固定并且要充分固定，以阻止这些酶导致假阳性。b. 使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液，导致出现假阳性。建议采用推荐的固定液。c. TUNEL检测反应时间过长，或TUNEL检测反应过程中反应液渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润，也可能出现非特异性荧光。注意控制反应时间，并确保TUNEL检测反应液能很好地覆盖样品。TUNEL检测荧光背景很高a. 支原体污染。请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染。b. 高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂。c. TUNEL反应过强。可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液稀释TdT酶2-5倍后再按照说明书操作。稀释后的TdT酶需当日使用。d. 红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。此时宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。TUNEL检测标记效率低a. 使用乙醇或甲醇固定会导致标记的效率较低。b. 固定时间过长，导致交联程度过高。此时宜减少固定时间。c. 荧光淬灭。Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭。解决方法是需注意避光操作。d. 碘化丙啶双染时，如果碘化丙啶染色过深会导致观察到的本试剂盒的TUNEL染色效果减弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激发产生的荧光，从而起到淬灭碘化丙啶。