多聚酶链式反应扩增DNA片段.ppt

1 1、多聚酶链式反应的概念：、多聚酶链式反应的概念：是一种在体外快是一种在体外快速扩增特定基因或速扩增特定基因或DNADNA序列的方法，故又称为序列的方法，故又称为DNADNA体外体外扩增技术扩增技术 2 2、多聚酶链式反应的应用：、多聚酶链式反应的应用： 的诊的诊断、断、 、 、 和和DNADNA 等各方面。等各方面。遗传疾病遗传疾病刑侦破案刑侦破案古生物学古生物学 基因克隆基因克隆序列测定序列测定1 1、DNADNA分子的组成成分和结构分子的组成成分和结构DNA DNA 分子的基本组成单位是分子的基本组成单位是 . .共有共有 种种, ,每个基本单位是由一分子每个基本单位是由一分子的的 、一分子的、一分子的 、和一分子的和一分子的 构成。构成。脱氧核苷酸脱氧核苷酸4 4磷酸磷酸碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖那么那么DNADNA分子的平面结构怎分子的平面结构怎样呢？样呢？二二 、基础知识、基础知识脱氧脱氧核糖核糖含氮碱基含氮碱基磷酸磷酸A G C T1 1、DNADNA的基本单位的基本单位12345OATGCAGCT5端端3端端5端端3端端 识别识别 ： DNA分子的分子的3 端与端与5 端端-OH端为端为3 ; 磷酸基团的末磷酸基团的末端为端为5。解旋酶解旋酶DNADNA母链母链4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶引物引物（ RNA）打开打开DNADNA双链双链模板模板合成子链原料合成子链原料催化子链合成催化子链合成使使DNADNA聚合酶能从引聚合酶能从引物物3 3端开始连接脱端开始连接脱氧核苷酸氧核苷酸 思考：思考：3 3、是什么？是什么？ 体外扩增体外扩增DNA DNA 如何提供相似环境？如何提供相似环境？ 变性变性（ 80-100 ）TaqTaq聚合酶（耐高温）聚合酶（耐高温）20203030个核苷酸构个核苷酸构成成DNADNA或或RNARNADNADNA双链反向平行双链反向平行3553DNA双链双链单链单链变性（加热变性（加热80-100 ）复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）一、一、PCRPCR原理原理 变性的目的：变性的目的：复性的目的：复性的目的：解开双链解开双链有利于引物有利于引物和引物和引物与两条单与两条单链的结合链的结合 一、一、PCRPCR的原理的原理（ PCRPCR的技术原理）的技术原理）1234522557294时间（时间（minmin）温度（）适温延伸高温变性低温复性重复13步30轮 步骤：步骤：变性变性 复性复性延伸延伸（1）PCR循环循环-变性变性9595变性变性（1）PCR循环循环-变性变性9595变性变性（1）PCR循环循环-变性变性9595变性变性（2）PCR循环循环复性复性5555复性复性（3）PCR循环循环延伸延伸（3）PCR循环循环延伸延伸（3）PCR循环循环延伸延伸（3）PCR循环循环延伸延伸二、二、PCR的反应过程的反应过程 5/3/3/5/5/3/引物引物5/3/引物引物变性变性95oC复性复性55oC延伸延伸72oC5/3/3/5/5 引物引物15 引物引物2第二次复制第二次复制第一次复制第一次复制5 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 4 4、循环特点：、循环特点：PCR一般要经历一般要经历 三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性、三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性、延伸三步。延伸三步。结果子代结果子代DNA中有最初母链的只两条（无引物存在于两个子代中有最初母链的只两条（无引物存在于两个子代DNA分子中）分子中） 。其它子代。其它子代DNA分子都为双引物分子式分子都为双引物分子式 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物并且由引物延伸而成的延伸而成的DNA单链会与引物单链会与引物结合，进行结合，进行DNA的的延伸，这样，延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的两个引物之间的DNA序列序列，处于两引物之间的，处于两引物之间的DNA序列呈指数增长序列呈指数增长12N 体内体内DNA复制与复制与PCR的技术区别：的技术区别：体内复制体内复制PCRPCR技术技术解旋解旋在解旋酶作用下，细在解旋酶作用下，细胞提供胞提供ATPATP，部分解开，部分解开加热到加热到9494o oC,C,双链全双链全部解开，不需解旋酶部解开，不需解旋酶引物引物一小段一小段RNARNA一般用一般用DNADNA片段片段DNADNA聚合酶聚合酶细胞自身的细胞自身的DNADNA聚合酶聚合酶（不耐高温）（不耐高温）TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶复制特点复制特点半保留复制，边解旋半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。边复制，多起点复制。半保留复制，完全解半保留复制，完全解旋后复制，从模板链旋后复制，从模板链的一端开始复制。的一端开始复制。复制的方向复制的方向 子链的子链的55端向端向 3 3端端延伸延伸子链的子链的55端向端向 3 3端延伸端延伸三、三、 PCR反应的实验操作反应的实验操作三、三、 PCR反应的实验操作反应的实验操作（1） （准备）（准备）按配方将所需试剂摆放在实验桌上按配方将所需试剂摆放在实验桌上 （2） （移液）（移液）用用微量移液器微量移液器按配方在微量按配方在微量离心管离心管中依次加入各组分中依次加入各组分 （3）（）（混合）混合）盖严盖严离心管离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁口的盖子，用手指轻轻弹击管壁 （4） （离心）离心）将微量离心管放在将微量离心管放在离心机离心机上上 （5）（）（反应）反应）将离心管放入将离心管放入PCR仪仪上，设置好上，设置好PCR仪的循环程序仪的循环程序 四、操作提示：四、操作提示： 操作提示操作提示 1 1为避免外源为避免外源DNADNA等因素的污染，等因素的污染，PCRPCR实验中使用的实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行进行高压灭菌高压灭菌。 2 2PCRPCR所用的缓冲液和酶应所用的缓冲液和酶应分装成小份分装成小份，并在，并在-20-20储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓冰块上缓慢融化慢融化。 3 3在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的剂后，移液器上的枪头都必须更换枪头都必须更换。所有的成分都加入。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离，再将微量离心管放在离心机上，离心约心约10s10s，使反应液集中在离心管底部，再放入，使反应液集中在离心管底部，再放入PCRPCR仪中仪中进行反应。进行反应。目的：目的：避免外源性避免外源性DNA大量扩增造成假阳性反应。大量扩增造成假阳性反应。五、结果分析与评价五、结果分析与评价 1 1、原理：、原理：DNADNA在在260nm260nm的紫外线波段有的紫外线波段有一强烈的吸收峰一强烈的吸收峰( (图图5-11)5-11)。可以利用。可以利用DNADNA的这一特点进行的这一特点进行DNADNA含量的测定。含量的测定。 测定测定并并 五、结果分析与评价五、结果分析与评价DNA 含量的测定：稀释含量的测定：稀释对照调零对照调零测定测定计算（公式见计算（公式见P63）波长波长260nm260nm处处读数读数蒸馏水蒸馏水做对照做对照5050倍倍六、课题延伸六、课题延伸 1 1、PCRPCR优点：优点： 2 2、PCRPCR技术的应用技术的应用P58P58原理虽然复杂，但操作却十分简单。快原理虽然复杂，但操作却十分简单。快速、高效、灵活和易于操作速、高效、灵活和易于操作 练习练习 ( (课堂检测课堂检测) ) 1 1、DNADNA单链的单链的_末端为末端为3 3端端, , _末端为末端为5 5端端, ,在在DNADNA复制时复制时, ,引引物从模板链的物从模板链的_端配对结合端配对结合. .在在_酶的作用下酶的作用下, ,从引物的从引物的_端端, ,使子链向下延伸使子链向下延伸. . 2 2每次循环可以分为每次循环可以分为_这三个过程这三个过程, ,对应温度分别为对应温度分别为_._.磷酸基团磷酸基团羟基羟基羟基羟基DNA聚合聚合3/变性、复性、延伸变性、复性、延伸9595、55 55 、72 72 9090以上、以上、5050左右左右 、72 72 左右左右练习练习 ( (教材教材P63)P63) 1 1、一个、一个DNADNA片段经过片段经过3030次循环后能形次循环后能形成成_个这样的片段个这样的片段. . 2 2、依据、依据DNADNA吸收紫外光的情况吸收紫外光的情况, ,用紫外用紫外分光光度计测得分光光度计测得 DNA=_DNA=_230l50 x(260nm50 x(260nm的读数的读数)x)x稀释倍数稀释倍数课堂小结课堂小结多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNA片段片段PCR原理原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响的变性和复性受温度影响PCR过程过程变性变性复性复性延伸延伸操作步骤操作步骤配制配制PCR反应体系反应体系移入离心管移入离心管放入放入PCR设置工作参数设置工作参数DNA扩增扩增测定含量测定含量稀释稀释调零调零测定并读数测定并读数计算计算练习巩固练习巩固1 1、关于、关于PCRPCR技术的应用，错误的一项是技术的应用，错误的一项是A A 古生物学、刑侦破案、古生物学、刑侦破案、DNADNA序列测定序列测定B B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学C DNAC DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案序列测定、基因克隆、刑侦破案D D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNADNA序列测定序列测定2 2、DNADNA的合成方向总是从子链的哪一端向的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？哪一端延伸？3 3、PCRPCR技术最突出的优点是技术最突出的优点是A A 原理简单原理简单 B B 原料易找原料易找C TaqDNAC TaqDNA聚合酶有耐热性聚合酶有耐热性D D 快速、高效、灵活、易于操作快速、高效、灵活、易于操作子链的子链的55端向端向 33端延伸端延伸4 4、做、做PCRPCR使用的微量离心管、枪头、缓冲使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是A A 反复洗涤反复洗涤 B B 不怕外源不怕外源DNADNA污染污染C C 高压灭菌高压灭菌 D D 在在-20 -20 储存储存