基层培训-免疫学技术.ppt

第五章 常用免疫学检验技术,临床免疫检验是运用免疫学基本的基本原理和技术，检查临床标本中的微生物抗原、肿瘤抗原以及相应的微生物抗体、自身抗体，为感染性性疾病、肿瘤、自身免疫病以及免疫缺陷提供诊断依据。,免疫检验分为两个部分，一部分为利用免疫检测原理检测免疫活性细胞、抗原、抗体、补体、细胞因子、细胞粘附分子等免疫相关物质，另一部分是利用免疫检测原理检测体液中微量物质如激素、酶、血浆微量蛋白、血液药物浓度、微量元素等。这些检测结果为临床上确定诊断、分析病情、调整治疗方案和判断预后等提供了有效的实验依据。,第一节 免疫学检验原理、特点和方法,一、免疫学检验原理 （一）抗原抗体反应是抗原与相应抗体之间的特异性结合反应。它既可发生在体内，也可发生在体外。在体内发生的抗原抗体反应即为体液免疫应答的效应作用。体外的抗原抗体结合反应，根据参与反应的抗原的物理性状（可溶性或颗粒性）以及参与反应的条件（电解质、补体等）不同，表现出不同的现象，如沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合和毒素中和等。一般将检查血清中病原微生物抗原和抗体的试验称为血清学试验。,抗原抗体反应可分为两个阶段。第一阶段为特异性结合阶段，此阶段仅需数秒至数分钟，但并不出现可见的反应；第二阶段为可见反应阶段，这一阶段抗原抗体复合物在适当的电解质、pH、温度和补体等的影响下，进一步交联聚集，出现凝集、沉淀、溶解和补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。第二阶段反应较慢，往往需要数分钟至数小时。这两个阶段不能严格划分，所需的时间也受多种因素的影响。,（二）抗原抗体反应的特点： 1、特异性 抗原抗体反应的特异性（specificity）是指抗原分子上的抗原决定簇和抗体分子超变区结合的特异性，由这两个分子之间空间结构的互补性决定的。形同钥匙与锁一样，所以抗原抗体的结合是有高度特异性的。例如白喉抗抗毒素只能与相应的外毒素结合，而不能与破伤风外毒素结合。因此，在抗原抗体反应的免疫学实验中，可以用已知的抗原或抗体来检测特定的相对应的抗体或抗原。,2、比例性 比例性（proportionality）是指抗原与抗体特异性结合反应时，生成肉眼可见结合物的量与反应物浓度的关系，只有当二者浓度比例适当时，才出现可见反应。抗原抗体分子比例合适的范围，称为抗原抗体反应的等价带。在此范围抗原抗体结合充分，沉淀物形成得快而多。,在等价带的前后，由于抗体和抗原的过量，上清液中可测出游离的抗体或抗原，形成的沉淀物少。当抗体过量时，称为前带，抗原过量时称为后带。因此，在抗原抗体反应的试验中，如果没有产生肉眼可见的抗原抗体复合物出现，一方面要考虑是否有抗原与相应的抗体存在，另一方面还必须注意到两者反应的比例是否适当。,3、可逆性 抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体的特性称为抗原抗体结合的可逆性（reversibility）。由于抗原抗体的结合是分子表面的非共价键结合，故形成的复合物是不牢固的，在一定的条件下可以解离，所以说抗原抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一动态平衡过程。,抗原抗体复合物解离取决于两方面的因素：一是抗体对相应抗原的亲和力；二是环境因素对复合物的影响。亲和力高的抗体与抗原表位在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不容易解离，反之，亲和力低的抗体与抗原形成的复合物较易解离。环境因素中的过高或过低均可破坏离子间的静电引力，使抗原抗体的结合力下降。增加离子强度，也可使静电引力消失，降低抗原抗体的结合力，促使其解离。解离后的抗原和抗体仍然保持游离抗原、抗体的生物活性。,（三）影响抗原抗体反应的因素 影响抗原抗体反应的因素较多，主要有两方面：一是反应物自身的因素，另一方面是反应环境的因素。,1、反应物自身因素 （1）抗原 抗原的理化性状、表面抗原决定簇的种类和数目均可影响抗原抗体反应的结果。如颗粒性抗原与相应抗体结合后产生凝集现象；可溶性抗原与相应抗体结合后产生沉淀现象；单价抗原与相应抗体结合后不出现沉淀现象。,（2）抗体 来源 来源于不同动物的免疫血清，其反应性有差异。家兔等大多数动物的免疫血清，由于具有较宽的等价带，与相应抗原结合易出现可见的抗原抗体复合物。马、人的免疫血清等价带窄，抗原不足或过剩，均易形成可溶性复合物。单克隆抗体一般不适合用于凝集和沉淀反应。,浓度 抗体的浓度往往是与抗原相对而言，二者合适的浓度才易出现可见的反应结果。 特异性和亲和力 特异性与亲和力是影响抗原抗体反应的关键因素，它们共同影响试验结果的准确程度。诊断试剂应尽可能选高特异性、高亲和力的抗体，才能提高试验的可靠性。,2、反应的环境条件 （1）电解质 抗原抗体结合后，由亲水性向疏水性转换过程中必须要有电解质参与才能进一步使抗原抗体复合物表面失去电荷，破坏水化层，使复合物相互靠拢聚集，形成大块凝集、沉淀。若无电解质存在，则不出现可见反应。在抗原抗体反应中，通常使用0.85%NaCl溶液或各种缓冲液作抗原抗体的稀释液及反应液。,（2）酸碱度 抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行，pH过低或过高都会影响抗原抗体的反应。抗原抗体反应中一般以pH69为宜。有补体参与的反应pH为7.27.4，超过这个范围会降低补体的酶活性而影响反应。,（3）温度 抗原抗体反应需要合适的温度才有利于二者结合。一般以1540为宜，最适温度为37。在此范围内，温度越高，抗原抗体分子运动越快，碰撞接触机会越多，两者结合反应速度越快。但是如果温度高于56，会导致抗原抗体复合物解离，甚至分子变性。温度越低，反应速度越缓慢，但抗原抗体结合越牢固，易于观察。,（4）振荡 在抗原抗体反应中，适当的振摇可促使抗原抗体分子的接触，加速其反应。,（四）抗原抗体反应的类型 随着免疫学技术的飞速发展，在原有经典免疫学实验方法基础上，新的免疫学测定方法不断出现，使免疫学实验技术更特异、更敏感和更稳定。目前根据抗原和抗体的性质不同，反应出现的现象和结果的不同，以及反应时参与的其他条件不同，将抗原抗体反应分为五种类型。,（1）可溶性抗原与相应抗体结合产生的沉淀反应；（2）颗粒抗原与相应抗体结合发生的凝集反应；（3）抗原抗体结合后激活补体所产生的溶细胞反应；（4）细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应；（5）标记免疫的抗原抗体反应。每种反应类型都包括若干实验技术。（见抗原抗体反列应表1）,表1 抗原抗体反应的类型和试验方法 - 反应类型 实验方法 结果判断 - 沉淀反应液相沉淀实验观察沉淀、检测浊度 琼脂凝胶扩散观察和测定扫描沉淀线或环 凝胶电泳技术观察和测定扫描沉淀峰弧等 凝集反应直接凝集实验用裸眼、放大镜或显微镜观察红 细胞或胶乳颗粒的凝集现象 间接凝集实验 同上 凝集抑制实验 同上 协同凝集实验 同上 抗球蛋白实验 同上 -,- 补体参与反应补体溶血实验 以裸眼或光电比色仪观察 测定溶血现象 补体结合实验 同上 中和反应 病毒中和实验病毒感染性丧失 毒素中和实验外毒素毒性丢失 标记免疫 荧光免疫技术 检测荧光 放射免疫技术 检测放射性 酶标免疫 检测酶底物显色、发光、荧光 发光免疫技术 检测发光 金标免疫技术 观察金颗沉淀线 -,二、免疫学检验方法和应用 （一）凝集反应 颗粒性抗原或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒后，与相应抗体（或抗原）发生特异性反应，在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应。凝集试验应用广而且敏感度高，方法简便，迄今已成为通用的免疫学技术之一，广泛用于细菌的鉴定和分型、抗原分析、测定抗体和诊断疾病等临床检验。在免疫检验技术中，根据参与反应的颗粒的不同，把凝集反应分为直接凝集反应和间接凝集反应。而自身红细胞凝集反应试验和抗球蛋白参与的凝集试验是两种特殊的凝集反应。,1、直接凝集反应： 细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体反应，当二者比例适当时，出现凝集，称为直接凝集反应。反应中的抗原称为凝集原，参与反应的抗体称为凝集素。常用的凝集试验有玻片法、试管法和微量血凝反应板法。,（1）玻片凝集试验：多用于定性。用以知抗体诊断血清与受检菌液在玻片上混匀，放置数分钟后如抗体与相应抗原反应即出现肉眼可见的凝集反应。如沙门菌玻片凝集试验。 （2）试管凝集试验：多用于半定量和定量试验，常用已知一定量的抗原（细菌、细胞等）与一系列稀释的病人血清混合，在保温放置后观察结果，判定受检血清有无相应抗体以及效价，如肥达反应。,2、间接凝集反应：将可溶性抗原（或抗体）先吸附或偶联与免疫无关大小适当的颗粒表面，使之成为致敏载体颗粒，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜的电解质存在条件下，出现特异性的凝集现象，称为间接凝集反应。其敏感度比直接凝集反应高28倍，亦明显高于沉淀反应。在临床上广泛用于各种抗体和可溶性抗原的检测。间接凝集反应试验可分为：,（1）间接凝集试验：用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体。将可溶性抗原与载体颗粒结合，再与样品中的抗体反应，形成肉眼可见的凝集颗粒或凝集块者为阳性。,（2）反向间接凝集试验：用已知特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗原。临床上用于检测HbsAg、AFP等。,（3）间接抑制试验：试剂为已知抗原致敏的颗粒载体和相应的抗体，用于检测标本中与致敏抗原相同的抗原。检测方法是将标本与抗体试剂混合反应，然后加入致敏载体，若出现凝集，说明标本中不存在相应抗原，抗体试剂未被结合，仍与载体上的抗原反应；如未出现凝集，则说明标本中含有相应抗原，凝集反应被抑制。,（4）协同凝集试验：其原理同反向间接凝集试验，但所用的载体是金黄色葡萄球菌，其细胞壁中有A蛋白（SPA），SPA具有能与特异性抗体IgG的Fc段结合的特性。当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成为抗体致敏的颗粒载体，若与相应抗原接触，就会出现反向间接凝集反应，常用于细菌、病毒、毒素及可溶性抗原的快速检测。,间接血凝试验：是以红细胞作为载体的间接凝集试验。可根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱。在临床检测中应用广泛，是经典的抗原抗体反应之一。 胶乳凝集试验：是以聚苯乙烯胶乳微粒为载体的间接凝集试验。 明胶凝集试验：即以明胶颗粒为载体的间接凝集试验。常用于血清中抗病毒抗体的检测。,间接凝集试验的应用 间接凝集试验具有敏感、快速、操作简便和不需要特殊仪器等优点，既可以检测抗原，又可以检测抗体。已广泛应用于医学检验。特别是对某些疾病的诊断治疗和效果的观察有着重要的参考价值。,（1）抗体的检测 用于检测微生物、寄生虫等感染所产生的抗体及自身抗体和药物抗体。如检测沙门菌抗体和类风湿因子等。 （2）抗原的检测 用于在临床上用反向间接凝集试验检测甲胎蛋白抗原和乙型肝炎病毒流行病学调查。在妇产科常用胶乳凝集试验检测孕妇尿中的绒毛膜促性腺激素（HCG）抗原。以诊断早期妊娠。,（二）沉淀反应 沉淀反应是可溶性抗原与相应抗体在适当的条件下发生特异性结合而产生沉淀的现象。沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖等可溶性物质。抗原与相应抗体再介质中或固相表面发生特异性结合，可分为两个阶段，第一阶段为抗原抗体特异性结合反应，在几秒或几十秒内就可完成，出现可溶性小附和物，十分快速，但肉眼不可见。在免疫比浊法中可以测定免疫复合物形成的速率，称为速率比浊法。第二阶段则形成大的可见的免疫复合物，需要几十分钟到数小时才能完成。如沉淀线或沉淀环。沉淀反应的常用试验方法有：,1、液体内沉淀试验 （1）絮状沉淀试验：将抗原和抗体溶液混合在一起，在电解质存在下，抗原与抗体结合形成絮状沉淀物。 （2）免疫浊度测定：是将光学测量仪器与分析检测系统相结合应用于沉淀反应，对各种液体介质中的微量抗原、抗体和药物及其它小分子半抗原物质进行定量测定的方法。,其原理是：当可溶性抗原与相应抗体在适当比例结合时，在特殊缓冲液中快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。采用透射比浊或散射比浊的方法，根据所测的吸光度值可推算出待测抗原的量。免疫浊度测定又可分为速率比浊法和终点比浊法。其优点是可以准确定量，校正曲线比较稳定，简便快捷，无污染，易于自动化，也适合于大批量标本的检测，在临床检验中得到了广泛应用。,2、凝胶内沉淀试验：利用可溶性抗原与相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。根据抗原抗体反应的方式和特性，发展为以下几种实验技术： （1）单向扩散试验：在琼脂凝胶中混入一定量的抗体，使待测抗原溶液从局部向琼脂内自由扩散，在一定区域内形成可见的沉淀环。,（2）双向扩散试验：在琼脂内抗原和抗体各自向对方扩散，在最适当的比例处形成抗原抗体沉淀线，观察沉淀线的位置、形状及对比关系，可作抗原和抗体的定性分析。 （3）免疫电泳技术：是将琼脂内电泳与免疫扩散相结合的一种常用的一种免疫学实验方法。有对流免疫电泳、火箭电泳、交叉免疫电泳、免疫电泳、固相免疫电泳等实验技术。,（三）补体结合试验： 是经典途径的抗原抗体反应之一，应用绵羊红细胞和溶血剂作指示剂，建立了检测抗原抗体与补体结合的方法，如检测梅毒的华氏试验（现已被淘汰）。凡是能激活补体的IgG、IgM类抗体与相应抗原结合的反应都可以用本法检测。目前主要用于病毒性传染病诊断、流行病学调查以及一些自身抗体、肿瘤相关抗原等的检测。,（四）免疫标记技术 免疫标记技术是将多种可以微量或超微量检测的示踪物（如荧光素、放射性核素、酶、化学或生物发光剂）对抗原或抗体进行标记，制成标记物，加入抗原抗体反应体系中与相应未标记抗体或抗原进行反应，使免疫反应结果可被灵敏地进行分析测定。可以不测定免疫复合物本身，仅对其中的标记物进行测定就可确定待测物质的含量。因此，免疫标记技术具有高度特异性和高度敏感性，由于它具有重复性好、准确性高、操作简便、易于商品化和自动化的特点，现已发展成为生物活性物质分析重要的方法之一。,1、放射免疫技术 放射免疫技术是利用放射性核素的灵敏性和精确性与抗原抗体反应的特异性相结合而创建的一类免疫测定技术。常用的放射性核素有 125I和 131I等，主要有两种基本类型：（1）放射免疫分析：是最经典的模式，是以放射性核素标记的抗原与反应系统中未标记的抗原竞争特异性抗体为基本原理来测定抗原含量的分析方法。（2）免疫放射分析：是用放射性核素标记的过量抗体方法。抗体与待测抗原直接结合，采用固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争放射免疫分析。,放射免疫技术由于其测定的灵敏度高，特异性强、精密度好，而且可对抗原和半抗原进行测定，对仪器设备条件要求不高，所以广泛应用于医学检验。常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。其缺点是：放射性污染和危害；常用核素半衰期短，试剂盒稳定期短、不易快速及自动化检验等，已逐步被其它标记免疫分析方法所取代。,2、荧光免疫技术 荧光免疫技术是将免疫学反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一种方法，是最早发展的一种免疫标记技术。其原理是利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本的待测抗原特异性地结合，采用高发光效率的点光源，透过滤光板发出一定波长的光，使结合在标本上的荧光素被激发而产生荧光，然后借助荧光显微镜观察底物片上的荧光染色形态，判断待测抗原或抗体。,荧光免疫技术在临床检验上常用作细菌、病毒和寄生虫的检验以及自身抗体的检测。免疫荧光间接染色法可用于测定血清中的抗体，如免疫荧光用于梅毒螺旋体抗体的检测是梅毒特异性诊断方法之一。间接免疫荧光试验是当前公认的最有效的检测疟疾抗体的方法。,3、酶免疫技术 酶免疫技术是经典标记免疫技术之一，是以酶标记抗体或抗原为主要试剂的一种标记免疫分析技术。酶免疫技术是利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体免疫学反应检测敏感性的一种标记免疫技术。临床常用的酶免疫技术是酶联免疫吸附试验（见第三章第3节）,酶免疫测定除具有高度的敏感性和特异性，酶标记试剂比较稳定，而且易与其他相关技术偶联，因此发展迅速。市场上各种符合质量要求的商品试剂盒（提供有包被好的的固相载体、酶标记物及其底物和洗涤液等全套试剂成分）和自动或半自动检测仪上不断研究发明问世，极大地促进了酶免疫测定技术的普及。特别是固相载体酶免疫技术与胶体金技术等的结合，使市场上出现了一大批适用于家庭及床旁检测的快速试剂盒，大大方便了人群的自我保健和临床的快速诊断。ELISA则应用更为广泛，几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可用以检测。,该技术的检测灵敏度高、特异性强、准确性好，酶标记试剂能够较长时间保持稳定，检测方法简便安全易行，而且容易与其他技术偶联衍生出适用范围更广的新方法等。因此，酶免疫技术在方法学上的研究重点除与其他标记免疫技术一样需制备高纯度抗原和高亲和力的特异性抗体外，还包括：选择高活性的纯化标记用酶；试验有效的交联试剂和交联反应，制备高质量的酶标记物；选用适宜的酶作用底物系统；确定有效的分离结合/游离反应物的方法；筛选操作步骤以及研究自动化测定技术等。,4、金标免疫技术 是以胶体金为标记物的免疫标记技术。（见第三章第4节）,第二节 免疫胶乳试验及应用,一、胶乳凝集试验原理及方法 （一）原理：胶乳凝集试验是以聚苯乙烯胶乳颗粒为载体的间接凝集试验。使用抗原或抗体致敏胶乳颗粒，再用此致敏胶乳检测相应的抗体或抗原。胶乳凝集试验所用的胶乳颗粒是人工合成的载体，均一性较好，性能比红细胞稳定，但与蛋白质的结合能力及凝集性能不如红细胞，因此胶乳凝集试验敏感性不如血凝试验。,（二） 试验方法： 1、胶乳凝集试验：在反应板的一格中，先加受检标本一滴，再加致敏胶乳一滴，连续摇动23min观察结果。胶乳凝集者为阳性。不凝集者为阴性。同时作阴、阳性对照。 2、胶乳凝集抑制试验：先加受检标本一滴，再加一滴相应抗血清混匀，再加一滴致敏胶乳抗原，连续摇动23min观察结果。胶乳凝集者为阴性，不凝集者为阳性。,（三） 注意事项： 1、受检标本和试剂的加入顺序应遵照规定的步骤，否则无法判定结果。 2、试剂一般保存在46较为适宜，胶乳试剂不能冷冻，试验前取出待接近室温时的温度再使用。 3、此试验一般作定性检测，严格的操作也能达到半定量的要求。滴加标本和试剂时，液滴大小应均匀一致，每滴约50l。,二、抗链球菌溶血素“O”的测定 （一）试验原理：在受检者血清标本中，加入适量的溶血素“O”。如标本中含有高单位抗体，中和后则有多余的抗体存在，与溶血素“O”致敏的胶乳试剂反应，可出现清晰而均匀的凝集颗粒。,（二） 试验步骤： 1、将溶血素“O”贮存液用生理盐水稀释到每ml含5和2.5结合单位的两种了应用液。 2、血清标本5630min灭活后用生理盐水作1：50稀释。 3、在胶乳试验反应板上滴入稀释血清标本1滴，再滴加2.5结合单位应用液1滴，轻轻摇动3min，使其均匀。 4、滴加ASO胶乳1滴，轻轻摇动8min，有清晰凝集者为阳性。 5、将阳性血清用5结合单位应用液重复试验，有清晰凝集者为强阳性。,（三） 临床意义 1、阴性者250u，阳性者ASO在330500 u，强阳性者ASO在625 u以上。 2、正常健康人ASO水平随地区、年龄、气候、季节、环境条件不同而异，通常成人在250 u以内，3岁以下儿童在100 u以内者均属正常。 3、A群溶血性链球菌感染后，80%85%的患者ASO升高。35周达最高值，两个月后开始下降，612个月恢复到正常水平。用于诊断急性风湿热和慢性风湿性关节炎。,（四）注意事项： 1、患者标本应新鲜，如被细菌污染或严重溶血者，可影响结果，引起假阳性。 2、高血脂标本，试管或试剂被胆固醇污染均可出现假阳性。 3、所用器具应清洁，取量要准确。,4、溶血素“O”单位标定不准，常可影响结果。每次试验应取一个已知的ASO单位的标本为对照，如出现偏高或偏低的结果，应重新测定溶血素“O”的结合量。 5、链球菌溶血素“O”在pH 6.5时活性最强，偏酸或偏碱均可影响结果。 6、胶乳试剂不可冰冻，放置4冰箱可保存一年。不同胶乳商品试剂有不同要求，操作前应仔细阅读说明书。,三、类风湿因子RF的检测 类风湿性关节炎（RA）是由自身抗体-免疫复合物引起的自身免疫性疾病。多发于青壮年，女性多于男性。患者由于感染、炎症等原因产生了变性IgG。变性IgG成为自身抗原，刺激免疫系统产生了各种抗变性IgG抗体，即类风湿因子RF。变性IgG与类风湿因子结合，形成中等大小的免疫复合物，沉积于关节等部位，激活补体，引起慢性渐进性免疫炎症性损害，严重时可累及心、肺和血管等，免疫学检查血清和关节滑膜液中出现类风湿因子。,（一）试验原理：胶乳凝集法，将热凝聚IgG包被于聚苯乙烯胶乳颗粒表面，如待测血清中含有RF，与相应抗原结合，产生肉眼可见的凝集反应。 （二）试验步骤：按试剂盒说明书操作，待测血清预先5630min灭活，再用0.1mol/L，pH8.2甘氨酸缓冲液作1：201：80稀释，取各稀释度血清一滴，加于反应板上，滴加RF胶乳试剂一滴，充分混匀并轻轻摇动反应板，3min内出现明显凝集者为阳性，,（三）临床意义 正常人用本法检测常为阴性。阳性主要见于类风湿性关节炎患者。另外，干燥综合征、冷球蛋白血症、亚急性细菌性心内膜炎、肝硬化、慢性肝炎等疾病也可阳性。因此RF对类风湿性关节炎患者并不具有严格的特异性，RF阳性不能作为诊断类风湿性关节炎的惟一标准。尽管在多种疾病RF可阳性，但是滴度均较低，随RF滴度增加。对类风湿性关节炎的诊断特异性也增高。多种疾病RF测定阳性率如表2。,表2 多种疾病RF测定阳性率 - 疾病 RF测定阳性率 - 类风湿性关节炎 79.6% 系统性红斑狼疮 30% 干燥综合征 95% 皮肌炎 80% 硬皮病 80% 混合性结缔组织病 25% -,注意事项： 本法检测出阳性主要为IgM类RF，阳性血清可连续双倍稀释测效价。每次试验均应设阴、阳性对照。其它见胶乳凝集法注意事项。,第三节酶联免疫技术及应用,一、酶免疫分析技术 酶免疫分析技术是以酶标记的抗体或抗原为主要试剂的方法，是标记免疫技术中使用最广泛的一种方法，具有灵敏度高、特异性强、酶标记物有效期长等优点，现已被广泛应用于医学检验和生物学的各个领域。,（一）原理和分类 酶是催化化学反应的蛋白质，它具有高效性和专一性的特点。酶免疫分析技术是将酶的催化放大作用和抗原抗体反应相结合的一种微量分析技术。酶标记抗原或抗体后，既不影响抗原或抗体免疫反应的特异性，也不改变酶本身的活性。免疫反应进行以后，酶还能催化相应的底物显色，最后利用酶标仪检测颜色的深浅来进行定性或定量分析。显色反应显示酶的存在，表示结合或游离的酶标抗原或抗体的量的变化。,根据反应过程中是否将结合的酶标记物和游离的酶标记物分离，把酶免疫分析技术分为两类：非均相酶免疫测定和均相酶免疫测定。非均相酶免疫测定抗原抗体反应平衡后，将游离的酶标记物和与抗原抗体结合的酶标记物分离开，再通过底物显色进行测定。其代表技术是酶联免疫吸附试验（ELISA）。而均相酶免疫测定由于免疫反应后酶活性的改变，不需将游离的和结合的酶标记物分开。主要用于小分子物质的测定。,（三）常用的标记酶和底物 （1）辣根过氧化物酶（HRP） 其分子量较小，溶解性好，易于提取，来源广泛；酶和酶标记物性质稳定，耐热、耐有机溶剂作用，易于保存，价格低廉；易于标记，标记后活性损失很小。因此HRP是ELISA中应用最广的标记用酶。,HRP底物种类很多，主要有邻苯二胺（OPD）和四甲基联苯胺（TMB），前者由于显色不稳定，对机体有一定致癌性，已逐渐被TMB所替代。 （2）碱性磷酸酶（ALP）和酶底物 （3）-半乳糖苷酶（-Gal）和酶底物，常用于均相免疫测定。,（四）固相载体 除均相酶免疫测定外，各种酶免疫测定最后都需要分离结合的酶标记物和游离的酶标记物。固相抗体（抗原）是最有效和简便的分离方法，因此抗体（抗原）固相载体是固相酶免疫测定必不可少的组成成分。,（1）塑料制品： 抗体或蛋白质抗原可通过非共价或物理吸附机制结合到塑料制品表面，材料经济、方法简便，目前，聚苯乙烯微量反应板是ELISA常用的固相载体。 （2）免疫微球 ： 由聚苯乙烯材料制成的塑料微球或颗粒，其直径常为微米或毫米，塑料微球与抗原或抗体偶联后，结合容量大，可以均匀地分散到整个溶液中，极大地增加了反应面积，因此反应速度快，洗涤、分离也方便。,（3）微孔滤膜载体： 是一种多孔性薄膜过滤材料，如醋酸纤维素膜、玻璃纤维素膜和尼龙膜等。广泛应用于定性或半定量斑点ELISA、免疫金标渗滤试验等。,（五）免疫吸附剂 是指于固相载体结合的抗原或抗体。将抗原或抗体固相化的过程称为包被。目前广泛使用的聚苯乙烯固相载体多采用吸附方式包被抗原或抗体。,二、酶联免疫吸附试验 （一）原理和类型 酶联免疫吸附试验（ELISA）就是以酶作为标记物、以免疫反应为基础的固相吸附测定方法。ELISA测定试剂主要包括固相包被的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和酶反应的底物等。结合在固相载体表面的抗原或抗体保持其免疫学活性，抗原或抗体的酶结合物既保留其免疫学活性，有保留酶的活性。,在测定过程中，抗原抗体结合反应在固相支持物上进行，用洗涤的方法使固相载体形成的抗原抗体复合物与其它物质分离，反应结果是以酶与底物作用后显色来判断的。显色的深浅与临床标本中待测物的浓度成正比或反比关系。所以可以根据显色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，可极大地放大反应结果，从而使检测方法达到很高的敏感度。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：,1、双抗体夹心法 是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合抗体及杂质。 （2）加待测标本，与固相抗体接触反应一段时间，标本让中的抗原与固相抗体结合（孵育），形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其它未结合物质。,（3）加酶标抗体。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合（孵育）。形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时，固相载体上带有的酶量与标本中待测抗原的量相关。 （4）加底物显色。复合物上的酶催化底物生成有色产物根据显色的深浅可进行该抗原的定性或定量（酶标仪比色或比浊）。,在临床检验中，双抗体夹心法适用于检测各种蛋白质等大分子抗原，例如乙型肝炎病毒表面抗原（HbsAg）、甲胎蛋白（AFP）、绒毛膜促性腺激素（HCG）等。不能用于半抗原等小分子的测定。,2、间接法测抗体 间接法是检测抗体常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体（即酶标二抗）检测已与固相抗原结合受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合抗原及杂质 （2）加稀释的受检血清。血清中的特异性抗体与固相抗原结合（孵育），形成固相抗原抗体复合物，经洗涤后，固相载体上只留下抗原抗体复合物。其它免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。,（3）加酶标记的抗免疫球蛋白（酶标抗抗体）。它与固相复合物中的抗体结合（孵育），形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，从而使该抗体间接标记上酶。清洗后，固相载体上的酶量与标本中待测特异性抗体的量相关。 （4）加底物显色。显色的深浅与标本中待测特异性抗体的量相关（比色或比浊）。,此法主要用于对病原体抗体的检测来进行传染病的诊断。 主要缺点是待测标本需要经过稀释后才能进行测定，否则血清中高浓度的非特异性IgG和其它干扰物质回引起阴性本底过高，造成假阳性。,3、双抗原夹心法测抗体 反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原包被固相载体和制备酶结合物，以检测相应的抗体。此法待测标本不需稀释，可直接用于测定，故其敏感度高于间接法。临床检验中，抗-HBs的检测常用此法。,4、竞争法测抗体 其原理为待测标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中的抗体含量越多，结合在固相上的酶标抗体越少，因此，阳性结果显色程度要浅于阴性结果。如抗-HBc的检测常用此法。,5、捕获法 捕获法（亦称反向间接法）ELISA，主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定。竞争法测抗体一般仅适用于检测IgG型抗体，IgM型抗体的检测用于传染病的早期诊断，如果用竞争法，即酶标记的抗人IgM作为酶标二抗进行间接ELISA测定，这样标本中同时存在的不同浓度的IgG型抗体将与IgM抗体竞争，使结合在固相抗原上的IgM抗体相应减少。另外，标本中如含有类风湿因子，也会产生干扰。,因此一般间接法测定IgM抗体不能得到准确的结果。而捕获法是用抗人IgM抗体包被固相载体，以捕获待测血清中的IgM，然后加入抗原，此抗原只于特异性的IgM结合，继续加入酶标记的特异性抗体，最后与底物作用，显色深浅与标本中特异性的IgM成正比。捕获法常用于病毒性感染的早期诊断，如甲型肝炎病毒（HAV）IgM抗体的检测。,6、其他ELISA 如应用生物素-亲和素放大系统的ELISA，利用酶催化底物发荧光的酶联免疫荧光测定（ELFIA），以及酶联免疫化学发光测定（ELICLA）等。新方法不仅进一步提高了测定灵敏度、特异性，而且使ELISA技术在提高自动化程度的同时，也便于单份样本测定，尤其适用于急诊、社区诊所及家庭化验。,第四节 金标记免疫分析技术,金标记免疫分析技术是一种以胶体金作为示踪物，用于抗原抗体反应的一种新型标记免疫测定技术，在20世纪70年代初期始创。由于胶体金能与多种生物大分子结合，已成为继荧光素、放射性核素和酶之后在免疫标记技术中常用的一种非放射性核素示踪物。由于它使用简便、快速，所以已广泛应用于临床检验工作中。胶体金与免疫活性物质（抗原或抗体）的结合物，又称胶体金标记物。,一、胶体金的结构 胶体金是氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒，并形成带负电的疏水溶液，由于静电作用而形成稳定的胶体状态，故称胶体金。 二、胶体金的性状 （一）胶体金的稳定性 胶体金颗粒大小多在1100nm，微小金颗粒均匀地、稳定地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液，因而具有胶体的多种特性，特别是对电解质的敏感性。,（二）胶体金呈色性 不同大小的胶体金呈色有一定的差别。最小的胶体金（25nm）是橙黄色的；中等大小的胶体金（1020nm）是酒红色的；较大颗粒的胶体金（3080nm）则是紫红色的。根据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色可粗略估计金颗粒的大小。 （三） 光吸收性 胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，这个吸收峰的波长（max）在510550 nm范围内，随胶体金颗粒大小而变化。,三、胶体金免疫测定技术 （一）斑点金免疫渗滤试验 1、原理 斑点金免疫渗滤试验（DIGFA）是以硝酸纤维素薄膜（NC膜）为固相载体，将抗体（或抗原）点加固定在上面，当待测标本滴加在膜上时，标本中所含的抗原被膜上抗体捕获，其后加入胶体金标记的抗体，它与已结合在膜上的抗原发生反应，形成固相抗体-抗原-胶体金标记抗体复合物，因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点。,2、双抗体夹心法操作和反应步骤 （1）将标记有抗体滤膜片的扁平塑料小盒打开，平放于实验台面上，在塑料小孔内滴加含待测抗原在标本12滴，待完全渗入盒内。 （2）在小孔内滴加胶体金标记抗体试剂12滴，待完全渗入盒内。 （3）在小孔内滴加洗涤液23滴，待完全渗入盒内。 （4）在膜中央显示有清晰的淡红色或红色斑点者判为阳性反应，反之则为阴性反应。斑点呈色的深浅可提示阳性的程度。全部试验可有5min内完成。,3、间接法操作和反应步骤 （1）用特异性抗原包被在微孔滤膜上，滴加待测抗体后，加23滴洗涤液洗涤。 （2）再滴加金标记抗体试剂12滴，待完全渗入盒内，加23滴洗涤淮洗涤。 （3）阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。该法由于血清标本中非目的IgG的干扰，易导致假阳性结果。,（二）斑点金免疫层析试验 1、原理 斑点金免疫层析试验（dot immunogold chromatographic assay ，DICA）是以硝酸纤维素薄膜为固相载体，由胶体金标记技术和蛋白质层析技术相结合的快速固相膜免疫分析技术。与斑点金免疫渗滤试验的滤过性不同，滴加在膜一端的待测标本受微孔滤膜的毛细管作用，向另一端慢慢移动，犹如层析一般，在移动过程中被分析物与固定于载体膜上某一区域的抗体（抗原）结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判定试验结果。,2、操作和反应步骤 （1）双抗体夹心法 以测定HCG为例，如图1所示，试条中G区为金标记的鼠抗人HCG，T区为包被的抗人HCG，C区为包被的羊抗小鼠IgG抗体。 测试时在A区滴加尿液（或将A区浸入尿液中），通过层析作用，尿液向B区移动，流经G区时将金标记抗HCG复溶，若尿液中含HCG，即形成金标记抗HCG和HCG复合物。,尿液继续移行至T区时，HCG复合物与抗HCG结合,形成金标记抗HCG-HCG-抗HCG复合物，金标抗HCG在T区显示红色线条，为阳性反应。 多余的金标记鼠抗人HCG抗体继续移行至C区时，被羊抗小鼠IgG抗体捕获，而显示出红色质控线条。如尿中不含HCG，在T区不出现红色线条，仅在C区出现红色线条，表示试验结果为阴性。如C区无红色线条出现,表示试验失败，可能为试剂条失效。见图3。,图1 斑点金免疫层析试验 图2 斑点金免疫层析试验双抗体夹心法原理示意图 竞争法原理示意图,图3 斑点金免疫层析试验（双抗体夹心法）结果判断示意图,（1）测定时待测标本加于A区，若待测标本中含有抗原，流经G区时结合金标抗体，形成待测抗原和金标记抗体复合物。 （2）当复合物移至T区时，因无足够的游离金标抗体与膜上标准抗原结合，T区无棕红色线条出现，结果为阳性。若标本中不含待测抗原，游离金标抗体则与T处膜上的标准抗原结合，在T处出现棕红色的条带，实验结果为阴性。 游离金标抗体或金标抗体复合物流经C区时，与该区包被的抗体结合出现棕红色的质控带，若C区无红色条带出现则为试剂失效。,（三）临床应用及评价 1、临床应用 （1） 感染性疾病抗原、抗体的检测 可检测的抗原有：HBsAg、HBeAg、大肠埃希杆菌抗原等。可检测的抗体有：抗- HBs、抗-HIV抗体、抗结核杆菌抗体、抗幽门螺杆菌抗体等。 （2）各种蛋白质的检测 如血清中的肌红蛋白、肌钙蛋白、甲胎蛋白、尿微量白蛋白、粪便血红蛋白等。,（3）激素的检测 包括人绒毛膜促性腺激素（HCG）、促甲状腺激素（TSH）、促黄体生成激素（LH）。其中尿液HCG的检测应用最广，产品品种最多。 （4）药物的检测 主要检测毒品类，如可卡因、吗啡等。