海藻糖航天食品应用（）.pdf

1分类号 密级 U D C 中国农业大学 博士学位论文 酶法合成海藻糖及其在航天食品中 应用的研究 Study on Enzymatic Synthesis of Trehalose and its Application to Space Food 研 究 生：王绍校 导 师：蔡同一 教授 专 业：农产品加工与贮藏工程 研究方向：果蔬加工 二二年六月 2 CHINA AGRICULTURAL UNIVERSITY Ph.D.DISSERTATION Study on Enzymatic Synthesis of Trehalose and its Application to Space Food Ph.D.Candidate:Shaoxiao Wang Supervisor :Prof.Tongyi Cai Major :Processing and Storage of Agricultural Products June,2002,Beijing i 目 录 中文摘要i 英文摘要iii 第一章 文献综述1 1.1 海藻糖的性质、生产工艺和应用1 1.1.1 海藻糖的结构与性质1 1.1.2 海藻糖的独特生物学功能及作用机理1 1.1.3 海藻糖的应用3 1.1.4 海藻糖的制备方法6 1.1.5 酶法合成海藻糖的研究进展7 1.2 甲醇酵母 Pichia Pastoris 表达系统9 1.2.1 甲醇酵母系统的优点9 1.2.2 甲醇酵母的生物学9 1.2.3 受体菌和载体10 1.2.4 甲醇酵母的转化11 1.2.5 甲醇酵母中表达蛋白的一般步骤12 1.2.6 甲醇酵母系统应用前景13 1.2.7 影响甲醇酵母中外源蛋白表达的因素13 1.3 航天食品15 1.3.1 太空食品的历史15 1.3.2 飞船食物系统16 1.3.3 空间站食品系统18 1.3.4 食品的研究和开发20 1.3.5 宇航员食谱的选择20 1.3.6 高级生命保障系统20 1.3.7 受控环境农业(Controled-Environment Agriculture,CEA)系统21 1.4 立题思路21 1.4.1 立题依据21 1.4.2 研究内容23 第二章 MTSase 和 MTHase 反应机制的研究24 2.1 引言24 2.2 材料与方法25 2.2.1 酶活力的测定25 ii2.2.2 MTSase和 MTHase最佳作用底物实验25 2.2.3 MTSase 和 MTHase 的水解作用26 2.2.4 HPLC 系统26 2.2.5 薄层层析26 2.2.6 还原糖含量的测定26 2.3 结果26 2.3.1 五种酶的酶活力26 2.3.2 MTSase 和 MTHase 生产海藻糖机制27 2.3.3 MTSase 和 MTHase 的水解作用32 2.4 讨论35 第三章 酶法合成海藻糖工艺的研究36 3.1 引言36 3.2 材料与方法37 3.2.1 菌种和培养37 3.2.2 试剂的配制37 3.2.3 主要仪器38 3.2.4 MTSase 的获得38 3.2.5 新型-淀粉酶（MTHase）的获得38 3.2.6 酶活力的测定39 3.2.7 酶的纯化39 3.2.8 糖的分析方法39 3.3 实验结果40 3.3.1 普鲁兰酶在酶法合成海藻糖工艺中的作用40 3.3.2-淀粉酶在酶法合成海藻糖工艺中的作用48 3.3.3 MTSase和 MTHase的不同配比对海藻糖产率的影响52 3.3.4 正交试验57 3.3.5 转化率的计算59 3.4 讨论59 第四章 酶法合成海藻糖的 HPLC测定60 4.1 引言60 4.2 材料与方法61 4.2.1 材料与试剂61 4.2.2 方法61 iii 4.3 试验结果61 4.3.1 海藻糖标样测定结果61 4.3.2 海藻糖合成反应终点的确定62 4.3.3 产物分析63 4.3.4 分离纯化后海藻糖纯度的测定63 4.3.5 薄层层析结果64 4.3.6 海藻糖转化率64 4.4 讨论64 第五章 海藻糖的纯化和结晶65 5.1 引言65 5.2 材料与方法65 5.2.1 试剂65 5.2.2 仪器与设备65 5.2.3 方法66 5.3 实验结果67 5.3.1 酶活力的测定67 5.3.2 最适加酶量67 5.3.3 反应产物的处理67 5.3.4 活性炭柱分离68 5.3.5 沉淀结晶70 5.3.6 显微摄影观察晶体形状70 5.3.7 红外扫描鉴定结构70 5.4 讨论71 第六章 航天食品速溶豆浆晶的研制72 6.1 引言72 6.2 材料与方法73 6.2.1 原料73 6.2.2 仪器与设备73 6.2.3 方法73 6.3 结果74 6.3.1 工艺流程74 6.3.2 操作要点74 6.3.3 豆浆中固形物含量的测定75 iv 6.3.4 复水性的测定75 6.3.5 蛋白含量的测定76 6.4 讨论76 第七章 嗜酸热硫化叶菌麦芽寡糖基海藻糖合酶基因的克隆和表达78 7.1 引言78 7.2 材 料 与 方 法79 7.2.1 菌株、载体和培养基79 7.2.2 试剂与材料79 7.3 实验结果86 7.3.1 PCR 扩增86 7.3.2 重组质粒的酶切鉴定86 7.3.3 甲醇酵母重组表达载体的构建86 7.3.4 重组表达载体的转化和转化子的筛选87 7.4 讨论89 全文总结与展望90 参考文献92 致谢99 作者简介100 I 酶法合成海藻糖及其在航天食品中应用的研究 中文摘要 海藻糖是由两个葡萄糖残基经半缩醛羟基缩合而成的一种非还原性二糖，该糖对生物体和生物大分子具有非特异性保护功能。在国外的航天食品中复水食品占有绝大多数。但是，由于复水食品复水后很难恢复原有的质构、风味和营养价值，其应用受到限制。海藻糖能够使复水食品复水后很好的恢复为原有的质构、保护风味物质。本论文主要采用重组酶法由淀粉合成了海藻糖，研究了重组酶的作用机制，合成海藻糖过程中海藻糖的分析方法，海藻糖的纯化和结晶，及海藻糖在航天食品速溶豆浆晶中的应用，另外还对来源于古细菌的麦芽寡糖基海藻糖合成酶在甲醇酵母中表达进行了尝试。主要研究内容如下：1 麦芽寡糖基海藻糖合成酶（M T S a s e）和麦芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶（M T H a s e）反应机制的研究 在大肠杆菌中表达的芝田硫化叶菌(S u l f o l o b u s s h i b a t a e)B 1 2的 M T S a s e和 M T H a s e两种酶，能够以直链淀粉或链长不小于麦芽四糖的麦芽寡糖为底物，首先由 M T S a s e 将直链淀粉或麦芽寡糖还原端的-1，4 糖苷键转变为-1，1 糖苷键，形成麦芽寡糖基海藻糖，然后 M T H a s e 作用于与海藻糖相连的-1，4 糖苷键，形成一个海藻糖分子，M T S a s e 和 M T H a s e合成海藻糖的作用有随链长增加而作用增强的趋势。它们在发生合成海藻糖作用的同时也产生副反应水解反应，在直链淀粉或麦芽寡糖还原端依次切除一个葡萄糖残基，产生葡萄糖。M T S a s e 和 M T H a s e 水解反应的最小底物分别为麦芽三糖和麦芽四糖。转糖基作用与水解作用可能由不同的活性中心完成。这一点目前还未见报道。实际反应中产生的葡萄糖大多来源于它们的水解作用。2 酶法合成海藻糖工艺的研究 以不同种类的淀粉海藻糖产率进行比较，糯淀粉被选为生产原料。通过不同加量的-淀粉酶、普鲁兰酶、M T S 酶和 M T H 酶的试验，确定了以 1 0%的糯淀粉乳为原料的最佳的海藻糖生产工艺参数，转化率在 80%以上。由淀粉多酶法生产海藻糖的成熟的工艺在国内还未见报道。3 酶法合成海藻糖的 H P L C测定 采用高效液相色谱法（H P L C）可以准确测定合成海藻糖反应中的海藻糖转化率。用色谱柱 R E Z E X R N M C A R B O H Y D R A T E，以水为流动相，在流速 0.6 m l/分钟，柱温 7 0 的条件下，可使样品中的海藻糖与其它寡糖很好地分离，再通过薄层层析法进行验证。采用外标法还可以定量测定样品中的海藻糖。4 海藻糖的纯化和结晶 II在酶法合成海藻糖反应产物中加入糖化酶，可以将麦芽寡糖、麦芽糖水解为葡萄糖，还可以将麦芽寡糖基海藻糖水解为葡萄糖和海藻糖，使产物中只有葡萄糖和海藻糖。采用活性炭柱分别用水和乙醇洗脱，可以将糖化酶作用后的产物中的葡萄糖和海藻糖完全分离。经浓缩结晶，得到高纯度海藻糖。5 航天食品速溶豆浆晶的研制 优质大豆经分选、浸泡、磨浆、过滤、除腥、加海藻糖、浓缩、真空干燥、粉碎、包装制成速溶豆浆晶，经测定证明：复水性好、溶解速度快、营养损失少、符合中国宇航员口味。6 含有多拷贝外源麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的分泌型毕赤氏甲醇酵母重组菌株的构建和筛选 克隆 MTSase 基因于质粒 pSK，序列测定以后构建了分泌型甲醇酵母重组表达载pPIC9K-MTS。经原生质球转化，G418、点杂交筛选，PCR 扩增确证基因整合到毕赤氏甲醇酵母染色体上。关键词 麦芽寡糖基海藻糖合成酶，麦芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶，海藻糖，酶机制，航天食品，豆浆晶，甲醇酵母 III Study on Enzymatic Synthesis of Trehalose and its Application to Space Food Abstract Trehalose was a kind of non-reducing a-a-linked glucose disaccharide,which could protect organism and biological molecules from damage.Most of space foods were rehydratable items in the NASA.However,because these rehydratable foods had lost their original structure,flavor,and nutrients during desiccated,their application were limited.Trehalose cound preserve fabric and flavor of dried food.This research involved synthesis,purification and determination of trehalose,reaction mechanism of MTSase and MTHase,and application of trehalose to instant-rehydratable-soybean-powder,which could be used as a item of Chinese space food.1 Study on reaction mechanism of MTSase and MTHase Recombinant MTSase and MTHase,expressed in E.Coli,could conver amylose or maltooligosaccharide of DP4 or higher to trehalose.After MTSase catalyzed the conversion of maltooligo-saccharides to glycosyltrehaloses,MTHase specially catalyzed the hydrolysis of the-1，4-glucosidic linkage that bound the maltooligosyl and trehalose moieties of maltooligosyl trehalose and produced a trehalose.The longer chain-length substrate,the higher yield of trehalose.The production of glycosyltrehalose was accompanied by side products such as one glucose and maltooligosaccharide shortened by one glucose residue from reducing end due to a side hydrolysis reaction.Unlike transglycosylation,MTSase could catalyze the side hydrolysis of maltotriose into glucose and maltose.Therefor it was presumed that the transglycosylation and the side hydrolysis of MTSase might be catalyzed by its two different active centers.There was the same side hydrolysis reaction from MTHase，except it could not hydrolyze maltotriose.The glucose in production mainly derived from their side hydrolysis.IV2 Study on synthesis of trehalose catalyzed by enzymes Because of a high yield of trehalose,amylopectin were used as material,and the optimum reaction conditions were determined.The best yield of trehalose reached 80%under these conditions.3 Application of HPLC in analysis of trehalose synthesized by a enzymatic system The trehalose,synthesized from starch,was analysed accurately by HPLC using REZEX RNM CARBOHYDRATE column at 70.The elution of saccharides was done with water at a flow rate of 0.6ml/min.Trehalose were isolated from other oligosaccharides thoroughly,which was verified by a following TLC.The yield of trehalose was accurately determined by this method.4 Purification and crystallization of trehalose Glucoamylase could hydrolyse maltooligosaccharide and maltose into glucose.Also it could hydrolyse glycosyltrehalose into glucose and trehalose.Eventually there were only glucose and trehalose in the production of synthesis,which were isolated easily by a active carbon column eluted with water and 10%ethanol.The pure tehalose was produced after concentration and crystallization.5 Process of instant-rehydratable-soybean-powder,a kind of potential space food After selected,saturated,ground into plasm,filtered,heated,added trehalose,concentrated,dried,pulverized,and packed,high quality soybean was processed into instant-rehydratable-soybean-powder,which was rehydratable,low nutrient lost and suitable to Chinese astronauts palate.6 Constructing of recombinant expression vector pPIC9K-MTSase and screening recombinant Pichia pastoris MTSase gene was Cloned into plasim pSK.After screened,Pichia Pastoris recombinant expression vector pPIC9K-MTSase was constructed successfully.By spheroplasts for transformation,and screening transformants by G418 resistance and dot blot.Two multiple integrents were obtained.Key words MTSase，MTHase，Trehalose，Reaction mechanism，Space food，Soybean powder，Pichia Pastoris.酶法合成海藻糖及其在航天食品中应用的研究 1 第一章 文献综述 1.1海藻糖的性质、生产工艺和应用 1 8 3 2年初，W i g g e r s首次从黑麦角中首次分离到海藻糖（t r e h a l o s e ）的结晶化合物。1 8 5 8 年，B e r t h e l o t 又从海藻（T r e h a l a m a n n a）中分离到这种物质,故命名为海藻糖（t r e h a l o s e ）。后来又发现该糖广泛存在于海藻、酵母、昆虫和高等植物等生物体内，特别是酵母、霉菌和蘑菇等真菌中，因此又称蘑菇糖（m y c o s e ）。近年来，随着其独特的生物学性质的发现，该糖逐渐成为一大研究热点。1.1.1 海藻糖的结构与性质：海藻糖是由两个葡萄糖残基经半缩醛羟基缩合而成的一种非还原性二糖。通常含两分子结晶水，分子式 C1 2H2 2O1 12 H2O，分子量为 3 7 8.3 3 D a，其结构式如下图:海藻糖有，,三种光学异构体，从酵母中提取的海藻糖为型,化学名称为-D-g l u c o p y r a n o s y l-D-g l u c o p y r a n o s i d e。其二水化合物是白色结晶，熔点为 9 7 ，溶解热 5 7.8 K J/摩尔，1 3 0 失水；其无水结晶熔点为 2 1 0 ，熔解热为 5 3.4 K J/摩尔，旋光度为 1 7 8 1。1.1.2 海藻糖的独特生物学功能及作用机理：海藻糖可以作为生物体的碳源和能源，但目前它倍受瞩目的原因，主要是该糖对生中国农业大学博士学位论文 2物体和生物大分子具有的非特异性保护功能 2。自然界存在一种非常奇特的隐生现象（c r y p t o b i o s i s ）：脱水保存数十年的花粉、种子、真菌的孢子和许多微生物如干酵母等，这些已无法检测到任何代谢活性的生物仅需复水化数分钟,就几乎完全恢复其原有活性。第一位描述“隐生现象”的科学家是荷兰的显微镜学家列文虎克（A n t o n v a n l e e u w e n h o c k）。1 7 0 2 年，他用新发明的显微镜观察自家水槽的干燥碎片时惊奇地发现:一些干燥的小颗粒在无菌水中又恢复了活力滑动起来。更复杂的一些隐生生物有复活植物、线虫、缓步肢节动物和盐水虾的胚胎等。加州大学戴维斯分校的 J o h n C r o w e 在 8 0 年代早期就指出：这些特性都源自这些生物体内大量含有的一种简单的糖类海藻糖(T r e h a l o s e)3。它在保持干燥过程中生物分子活性方面扮演了重要角色 4，有的含量竟达细胞干重的 3 5 。最典型的例子就是我们熟知的活性干酵母。研究表明：酵母细胞内海藻糖是一种典型的代谢应激物，其含量与细胞对逆境的耐受程度呈正相关性 5 6 7 8。近年来，国内也有这方面的研究报道 9 1 0 1 1 1 2 。昆虫体内海藻糖主要存在于血淋巴中，是血糖的主要成分 1 3。对昆虫耐冷性的研究发现，海藻糖能够降低昆虫体内形成冰核的过冷点，从而提高昆虫的耐寒能力 1 4 。从肌肉中分离的肌浆内质网作为一种生物膜模型，在对其进行干燥保存的研究中发现：当没有海藻糖存在时，生物膜在脱水干燥处理的过程中，其囊泡结构易于聚集。这种形态学的破坏使膜结构在复水后，其钙离子通道的活性几乎完全丧失。而当生物膜在干燥处理过程中有海藻糖存在时，囊泡结构不再发生形态学的破坏，钙离子通道的活性与未经处理的新鲜膜的活性一致。这种加入海藻糖后干燥处理的生物膜在与氧隔绝的情况下，其稳定性可以保持至少六个月。如葡聚糖、单糖类没有类似效果。海藻糖可以在细胞处于饥饿、干燥、高温15、高渗透压及有毒试剂等胁迫环境时，有效地维持细胞内质膜和蛋白质的稳定16171819。目前，海藻糖稳定蛋白、脂类糖类等大分子的机制尚不十分了解。但它无疑与保持这些分子的形态和构造有关，并且阻碍它们发生化学反应。实际上所有生物大分子在水溶液中的构象都至少部分依赖一种“结构外壳”。它是由水分子中氢原子与溶液分子表面键合产生的。一种理论认为，海藻糖是通过其羟基基团来保护大分子的，羟基形成的氢键可取代通常状况下溶质表面与水分子的作用，这就是“水代替假说”3 2 0。但迄今为止，还未发现海藻糖的羟基与所知的蛋白间的特殊的相互作用。而将海藻糖视为一种“无水水”的观点也有待修正。另一种是“玻璃体”假说 2 1。海藻糖与生物大分子形成一种类似水晶状的玻璃体结构，使生物大分子位于玻璃体内而维持原来的空间结构，从而在干燥及冷冻时可得到有效的保护。海藻糖作用的重要因素可能是：如同所有的糖类物质，海藻糖可使溶液通过以糖浆或玻璃体而非晶体结构逐渐交换而干燥。海藻糖在组织内形成玻璃体的能力可能酶法合成海藻糖及其在航天食品中应用的研究 3是隐生生物渡过干燥存活的关键。即便是极微量的水也会影响糖处于玻璃态的温度，这也许表明了不完全干燥的物质是不稳定的。还没有数据表明除水以外的其它分子，对储藏过程中玻璃态的稳定性有所影响。食品中除了糖和水外还有盐类和其它多种离子。研究表明：纯海藻糖的玻璃体保存在 2 3-3 7 极端干燥的条件下时，几天后会变得不透明及产生微结晶。但只要这些玻璃体含有及少量的蛋白就能保持澄清和稳定。似乎食品分子本身也参与确保海藻糖成分在苛刻的环境下也能以玻璃态干燥。玻璃态过渡论点更吸引人的地方是：它解释了对水果果酱进行操作所得到的结果。在以海藻糖干燥的食品中，芳香酯类能够以原有构型被包裹在海藻糖的玻璃体中。可以想象在干燥后期，海藻糖紧贴食物分子的外层，形成了玻璃“瓶子”结构。由于这种“瓶子”是由糖构成的，在湿润状态下能迅速溶解并释放出挥发性的内容物。虽然许多糖类都能转变为玻璃态，但海藻糖有一个明显的优点是它不吸水。即使在正常温度下，蔗糖的玻璃体也会因吸水而变粘。吸入的水分使蔗糖的表面溶解而逐渐形成了一种更稳定的结晶形式。这种现象在食品工业中被称为“哭泣现象”。它会使煮开的糖失去澄清性和本来的品质。当糖的玻璃体结晶的时候，它不可避免的变成多孔状，另挥发性芳香分子散发出去；相反的经由海藻糖干燥的食物分子全被完好的封存在玻璃体中。干燥处理限制性内切酶，它仍有不可思议的稳定性，表明玻璃体可能不是海藻糖发生保护作用的唯一途径。这些经海藻糖处理过的酶即便是被放在比海藻糖的溶液形成玻璃体温度更高的温度下，也能得到很好的保护。在其它的研究中也发现了这种现象。这表明，海藻糖的化学稳定性在此反应中也是至关重要的。海藻糖对脱水生物膜的保护作用322已经有了较为深入的研究。它与生物膜上的磷脂分子的极性头部相互作用，增加了磷脂分子的头部之间的空间，同时降低膜脂质的相变温度，使脂质处于液晶态，从而保护其结构和功能。1.1.3 海藻糖的应用 1.1.3.1 在食品工业中应用：新鲜就是最好，但用于储存和运送新鲜食物所耗费的财力和物力是如此之大。有些国家甚至有超过 3 0%的易腐食品消耗在储存和运输过程中。由于水占到多数动植物体5 0-9 5%的重量，所以干燥可大大缩小生物体的体积和重量。风干也许是最古老的食品保藏方法，它廉价、简捷而快速。缺点是通常食物的色泽、质感和味道也会有所改变。也许有一些改变是人们欢迎的：如葡萄干、李干、杏干和鱼干，都已成为特定的食品。但绝对没有人说干燥过的牛奶、鸡蛋和肉类也和原来新鲜时一样可口。理想的干燥工艺应该具有风干的优点而且还能保持新鲜食品的所有特质。海藻糖能使原来不稳定的酶在如此苛刻的条件下保持如此长的时间，它也能对天然食物中中国农业大学博士学位论文 4不稳定的生物分子混合物起保护作用。人们将目光集中在将海藻糖溶解在液体或液化的食物中，这样海藻糖就能与食物分子紧密接触。例如将海藻糖与鲜鸡蛋混合，在 3 0-5 0干燥，制成的黄色无气味的粉末能于室温下存放。复水时得到的产物与新鲜鸡蛋几乎没有差别。添加海藻糖并干燥处理的香蕉、草莓、芒果、鹗梨和覆盆子的果酱。当干粉被复水，即使延长储存期，仍能恢复色泽及其形状。新鲜草本植物在海藻糖溶液中浸泡后干燥，复水后仍能存活。许多食物的特有香味和风味，尤其是对水果和草本植物来说，主要靠散发挥发性的香味分子。加入海藻糖干燥后的干粉并没有食物在新鲜时的气味，但加水后它们很快便能散发出特殊的香味。1 9 9 0 年 Q u a d r a n t 品尝委员会报告：用海藻糖干燥的果酱口感新鲜、香味纯正，而不添加海藻糖的产品有明显的蒸煮味。为使这种源自主观的评价得到确证，R e a d i n g 大学食品学院对复水芒果果酱，复水后所释放出的挥发性香味成分进行了分析。他们的测试表明：海藻糖干燥的样品挥发出的芳香酯类物质的数量和密度都较大。更令人惊奇的是糖醛与绿草酮的量都有下降，它们是典型的美拉德反应产物，也是食品储藏过程导致腐败的的主要原因。这一反应发生于大多数风干食品中。还原糖与蛋白质、肽类或氨基酸反应产生褐色物质及散发蒸煮味。作为一种稳定的非还原糖，海藻澡糖本身不参与美拉德反应 2 3。但在海藻糖干燥的食品中发现较少量的美拉德反应产物表明：它也能抑制水果中天然的糖与蛋白质的反应。海藻糖保护生物分子在干燥中免于损伤的特性可被广泛应用于食品工业生产领域。用于诸如奶、蛋、汤类食品的保存。海藻糖不仅无色无毒 2 4 而且极易溶于水，因此含海藻糖的干燥食物绝无可能产生令人讨厌的异味。许多双糖由于不能被消化，当大量食用时，会造成呕吐、胃涨气、腹泻等症状，然而海藻糖却罕有这种效果。在人与许多动物的肠道内还含有海藻糖酶，能将海藻糖迅速的分解为两个分子的极易吸收的葡萄糖。以海藻糖干燥后的食物甚至可能比不通过海藻糖干燥的食品具有更高的营养价值 2 5。海藻糖可能能够包裹并保护一些如维生素的小分子。海藻糖能提供的热量与葡萄糖相当。英国的新食品及工艺咨询委员会已向政府提出应用海藻糖的建议。商业化应用海藻糖干燥工艺存在的问题之一是，工业风干的方法破坏性太大，为了加快水分的挥发速度，食品常被加热至 2 0 0 以上，这就使海藻糖原来能够保护的分子受到破坏。替代的方法是在较低的温度下干燥，但所需的真空设备的购买和运行非常昂贵。为了解决这些问题，采用大气控制部分压力干燥方法（C A P P），因为这种方法是利用干燥空气的循环来带走水蒸气，它能使食品在常温常压下迅速干燥，并且不会损失除水蒸汽外的其它挥发性物质，芳香性的食品就可在保持大部分香味成分的条件下被干燥。人们大部分工作是瞄准了海藻糖用于干燥液态或果酱类的食品，这种加工手法可扩展到切片食物。例如，将香蕉片浸入含海藻糖的溶液里，然后将之风干。这些切片在室温下放了一年多的时间，而其颜色和结构都得以保存，而同样的没有经过海藻糖处理的切片就逐渐变成褐色并腐坏。如此说来，诸如水果、蔬菜或加工过的海鲜等复杂的食物酶法合成海藻糖及其在航天食品中应用的研究 5的储藏也是可行的，尤其是经由基因工程改造能象隐生生物一样自己合成海藻糖的 2 6。1.1.3.2 海藻糖在生物工程中的应用:海藻糖具有非还原性和保护生物大分子的特性，可以作为生物制剂和生物制品的稳定剂 2 7。用海藻糖干燥的抗体 2 8 2 9，血小板，病毒，淋巴细胞，酶 3 0 3 1 3 2 3 3 等生物活性物质，无需冷冻，待复水后均能恢复活力 3 4。例如，海藻糖在乙醇脱氢酶和超氧化物歧化酶（S O D）反复冻融时可以稳定其酶活力。另外，用海藻糖替代血浆作为疫苗等生物制品的稳定剂，生物制品不仅能常温存放，节省冷藏费用，而且避免了因血源污染引起的乙肝等疾病的传播。剑桥的 Q u a d r a n d研究基金会研究在常温及极端条件下，海藻糖是否都有保护的功能。1 9 8 5 年，他们第一个实验是：将海藻糖加入某种单克隆抗体中然后在 3 7 风干。复水时单克隆抗体的活性未丧失，而没加海藻糖的对照组则几乎没有活性了。添加了海藻糖的单克隆抗体在室温下储存了几年以后仍然能使用。用海藻糖处理、干燥其它多种蛋白，包括酶和血液凝集因子，都取得了不错的效果。一些不稳定的酶类，它们在分子生物学中常被用来做 D N A的修饰。通常这些酶要储藏在-2 0，并添加甘油抗冻。添加海藻糖后，修饰酶和限制性酶均可在室温下从溶液中脱水而不丧失活性。限制性内切酶在 7 0 放置 3 5天后仍能准确切割 D N A。它们在3 7 储存 9 个月后或在 2 0-3 0 的高低温循环中也能保持活性。另一方面，未加入海藻糖时，这些操作会使酶活性消失。只有海藻糖有这种保护功能，其它的还原糖诸如乳糖和麦芽糖在更为温和的条件下，3 7 3 5 天都不能保存。别的广为使用的稳定剂如葡聚糖、单糖类也没有类似效果。世界卫生组织的一项全世界范围内的防疫计划是在 2 0 0 0年前消灭小儿麻痹症。与1 9 8 0 年消灭天花运动相似。然而与天花疫苗不同的是：小儿麻痹症疫苗如果不在冻存条件下会迅速降解，这个问题严重的制约了整项计划的展开。口服小儿麻痹症疫苗（O P V）与麻疹与风疹疫苗一样主要成分是活体病毒。世界卫生组织要求疫苗至少能在 4 5 下保存一周时间。海藻糖至少能使一部分病毒干制剂保持稳定。例如噬菌体 X G T 1 0在含海藻糖的溶液中干燥，在 3 7 保存六个月后，复水时仍能产生正常的有感染性病毒。单支O P V 在 4 5 时也与冷藏于 4 的液体疫苗一样稳定。用海藻糖抗干燥性生产高活性疫苗的巨大潜力，将使发展中国家的医疗卫生事业发生革命性进展。海藻糖的这一特性对微生物的菌种保藏 3 5 3 6 3 7 也具有重要意义。以保加利亚乳酸杆菌（L.b u l g a r i u s ）为例，该菌在冷冻和冷干情况下很难存活，但经 3.3 m o l/L 海藻糖处理后，其抗冻能力明显提高。经-6 0 3 7 反复冻融，该菌能保持 5 0 8 0 的存活率。大连医科大学的温朗聪等人考察了海藻糖对 D M 8 5 0 4 双歧杆菌有良好的冷干保护效果 3 8，优于其它保护剂。无水海藻糖也可用作一些易失活物质的常温脱水剂，可使淋巴液、生物制剂液、酶液等在不加热的情况下脱水。海藻糖的保湿性能，用于皮肤化妆品，作为洁肤剂、皮肤保湿剂、紫外吸收剂，也被用于糖衣和外伤治疗的膏药中。中国农业大学博士学位论文 6另一方面，海藻糖可作为生物反应中的激活剂与稳定剂，不仅可在高温下保持酶的正常活性，甚至起热激活作用，还能用于提高干燥保存的酶活性。在反应体系中加入海藻糖，使热敏感的酶在高温下稳定性和活性增加，可当作耐热酶使用。例如，未加海藻糖的限制性内切酶 N c o 在 5 0 时失活，加了海藻糖时酶活力反而升高。有试验表明海藻糖通过影响蛋白的水合作用来稳定和激活蛋白。海藻糖还具有分子伴侣的功能，阻止酶发生不可逆的热凝聚-热变性。生产中利用海藻糖热稳定和热激活的双重功能，可以减少酶的用量和提高反应速率，提高反应程度和总效率，获得标准反应条件下不可能的产量。这在生化反应、诊断或工业生产等领域的一系列酶反应中都有很大应用潜力。另外，利用热稳定和热激活的作用，可开发以前在常规反应条件下不可能进行的反应。例如专一性要求特别高的核酸杂交实验，反应体系加入海藻糖，就可在适宜温度下同时使用几种限制/修饰酶，提高杂交反应特异性，减少假阳性结果。1.1.3.3 海藻糖在农业上的应用：经海藻糖预处理的植物种子或幼苗的抗寒 3 9，抗盐能力有极大的提高。用 0.1 的海藻糖溶液浸稻种，经 2 和 6 低温处理后，水稻幼苗细胞电解质渗透率有显著降低，而淀粉酶活性有提高 4 0。这意味着修复寒害的能力提高，说明利用有关海藻糖的基因构建的转基因植物将有很强的抗逆性 4 1 4 2。随着资源与环境压力的日益增大，迫切需要开发利用盐碱地和干旱地，其中最重要的手段就是开展植物抗渗透胁迫的基因工程研究。目前微生物中海藻糖代谢途径的研究 4 3 已取得了很多成果，克隆和表达了该途径上多种酶的基因 4 4，如大肠杆菌海藻糖合成酶基因 o t s A 和 o t s B 等 4 5，为构建含有关海藻糖基因的转基因植物提供了有力的工具 4 6 。已有报道，G o d d i j i n 和 P i l o n-S m i t s 等人将大肠杆菌的 o t s A 和 o t s B 基因成功转入烟草植株，使该植株在干旱条件下生长情况有明显改善，国内也有类似的报道 4 7 4 8。1.1.4 海藻糖的制备方法：1.1.4.1微生物抽提法：霉菌、酵母、乳酸菌和一些其它真菌都含有海藻糖。可以选育高含量者作为提取源。其中从酵母中提取的海藻糖在国内外已有商品供应。国内多家单位已将此方法转入中试 4 9 5 0。目前海藻糖主要从酵母中提取 5 1 5 2 5 3，但回收率较低，制造成本过高，价格昂贵。1.1.4.2发酵法：在一定的基质上培养微生物，通过微生物发酵产生海藻糖，再由培养液精制而成。如正烷烃为碳源培养节杆菌属（A r t h r o b a c t e r ）的发酵生产，以砂糖和葡萄糖为基质培养短杆菌属（B r e v i b a c t e r i u m ），棒杆菌属（C o r y n e b a c t e r i u m ）等氨基酸发酵微生物的发酵生产，还有利用诺卡氏菌属，丝核菌属（R h i z o c t o n i a ）,微球菌属(M i c r o c o c c a c e a e)，胶样菌属 5 4，灰树花 5 5 等微生物发酵生产。