丙型肝炎疫苗.doc

丙型肝炎疫苗研究进展丙型肝炎的流行现状1989 年，choo 等（1）采用差异展示分析法首次获得人丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)的 cDNA 克隆，并证实它是输血传播的非甲非乙型肝炎的主要病原体。1991 年，国际病毒分类学会将 HCV 归为黄病毒科丙型肝炎病毒属。HCV 基因组变异较大，分为基因型、亚型、分离株、准种四个层次。世界范围内 HCV 主要有六个基因型，80 多个亚基因型，流行情况与地理和人群分布相关。我国主要为 lb，2a，3b 型，其中以 lb 型最多。目前全世界约有 4 亿 HCV 感染者，约有 70 一 80%的 HCV 感染者最终会导致慢性肝病(2)，随病程延长有一定比例发展为肝硬化和肝细胞癌。在发达国家，丙型肝炎占急性肝炎病例的20%，占慢性持续性肝炎的 70%，占晚期肝硬化的 40%，占肝细胞癌的 60%，已经成为肝脏移植的主要病因，同时也是阻碍肝移植的重要原因。在美国，约 400 万人通过输血感染 HCV，大多数转为慢性，美国的疾病预防控制中心估计该国每年有八千到一万人死于丙型肝炎及相关疾病，预计未来 20 年内死亡率将增加 3 倍以上，大大超过艾滋病。1991 一 1995 年，我国一般人群 HCV 阳性率为 2.15%，与血液接触频繁的人群 HCV 感染率高达 50%以上，急性丙型肝炎转为慢性的机率为乙型肝炎的 2 一 3 倍，慢性肝炎、肝硬化及肝细胞癌患者 HCV 阳性率分别为 13.3%、23.8%和 13.3 一 14.5%，急性肝炎患者中合并 HCV 感染及重叠感染率为 62.2%（3）。目前认为丙型肝炎主要通过血源传播，不洁血液制品、反复注射毒品导致的 HCV 感染占 90%，反复使用污染的注射器，己经导致全世界 230 一 470 万人感染 HCV。其他还有血液透析、生殖、性行为和职业传染等。HCV 疫苗开发的必要性丙型肝炎病毒感染后，机体的免疫力下降，HCV 会长期存在引起肝细胞内淋巴细胞浸润及肝坏死。更主要是 HCV 病毒基因高度变异性,可逃逸机体免疫系统的识别,因此,给 HCV 感染治疗带来了很大的困难。目前 HCV 感染治疗方法,局限于疗效欠佳的干扰素和利巴韦林，而且价格昂贵，无法普及。因此对 HCV 的治疗和预防现在成为全世界关注的重点。寻求一种高效预防和治疗 HCV 感染的方法是当务之急。而疫苗是预防病毒性疾病感染和传播的有效手段，并可为抗 HCV 免疫治疗和基因治疗提供新的思路。HCV 疫苗的研究概况早期的研究发现 HCV 具有慢性感染的趋势，而且康复期的患者和黑猩猩容易重复感染。对于这些问题人们现在有新的认识。首先，急性感染中有 50%的概率会出现自发的清除，这种病毒的清除是与特异性的免疫反应相关的（4）。因此通过相应的免疫重新激发这种免疫反应是理想的选择。其次，在人体和黑猩猩中发现能够清除病毒的天然免疫（5,6）。虽然有些患者重复感染后发展为慢性感染，但绝大多数情况下，即使是不同的病毒株，康复期的患者和黑猩猩也不会重复感染，这表明至少产生了部分有效的免疫作用。研究表明患者和黑猩猩体内早期诱发的多特异性 CD4+Th 和 CD8+T 细胞反应可以有效清除病毒（7）。这两种类型 T 细胞都可以分泌 IFN-γ，这种细胞因子在体外培养的细胞中对HCV 复制子具有直接的抗病毒作用，在急性感染期则可以大量减少病毒滴度。除此之外，利用表面携带 HCV 包膜蛋白的慢病毒/HCV 假型颗粒(HCVPP)进行检测表明，患者体内的抗体不仅只与一种基因型的颗粒反应，而且可以与多种基因型的 HCV 颗粒反应（8），说明患者体内存在范围较广的交叉中和性抗体。过去几年的研究结果有助于人们了解病毒与宿主之间复杂的斗争。这种病毒并不整合在宿主的染色体上，而是进化出多种机制来逃避宿主的反应（9,10）。HCV 抑制 NK 细胞（11），产生逃逸 CTL 和中和性抗体的突变体，它可以通过脂蛋白的伪装躲避病毒中和性抗体的结合（12），并在持续感染的情况下，能下调病毒特异的效应 T 细胞。如果宿主体内能尽早诱导产生病毒特异且广谱(针对准种)的 CD4+Th 和 CD8+T 细胞反应，产生天然免疫的 NK 细胞，以及病毒中和性抗体，就会实现病毒的清除。在二十年前，人们对 HCV 的疫苗不抱有太大的希望，因为 HCV 不仅在体外无法培养，而且具有遗传异质性，由于 HCV 的 RNA 聚合酶缺乏校正机制，使病毒能迅速突变以适应环境，逃逸宿主的免疫系统。这样就给疫苗的研究带来许多的困难。直到最近，人们才刚刚建立了 HCV 的体外细胞培养模型（13-15），因此还未能得到传统的灭活或减毒病毒疫苗。人们开始尝试亚单位疫苗的研究。亚单位疫苗范围很广，包括由病原体中纯化的抗原；携带编码抗原基因的质粒DNA;利用完整的重组病毒作为载体；以及化学合成的短肽。与传统的疫苗相比，亚单位疫苗具有以下优点：(l)去除了病原成分的疫苗不具有传染性：(2)根据特定目的设计的疫苗，不仅可以去除毒素，而且可以诱导重要的免疫反应清除感染：(3)可以应用于无法进行细胞培养的 HCV疫苗研制中。科学家们为了研制有效的 HCV 疫苗，进行了各种尝试，采用了各种策略例如：重组病毒疫苗、DNA 疫苗、融合蛋白疫苗、口服疫苗等。研究的热点包括包膜蛋白 El/E2、核心蛋白 C 到非结构蛋白 NS3 以及 NS5。但是目前暂时还没有一种成功的 HCV 疫苗问世。目前正在研制的 HCV疫苗主要有两大类：重组蛋白疫苗和核酸疫苗。另外还有一些新型的 HCV 疫苗如病毒样颗粒疫苗、细胞表位疫苗等。重组蛋白疫苗在小鼠,猕猴,大猩猩体内进行候选蛋白疫苗的评价均有报道。最先被选择的抗原是 HCV 编码的糖蛋白。动物细胞表达的两种蛋白 El 和 E2 形成了无二硫键连接的糖蛋白 gPE1-gPE2 异二聚体。与水/油构成的佐剂混匀后，免疫黑猩猩，可以诱导抗包膜蛋白抗体反应和 Th 细胞反应（16）。早期的实验表明如果用与 E1、E2 同源的病毒攻击，抗体滴度最高的黑猩猩可以得到完全的保护反应。这种保护反应与高滴度的 E2 抗体直接相关，该抗体能够阻止 E2 与 CD81 的结合。而且，尽管抗体水平较低的黑猩猩感染了 HCV，但大多数阻断了急性感染，只有少数发展为慢性感染。由 HCV-1 克隆而来的抗原是否能保护异源的病毒株，这是最关键的问题。利用 HCV-H 株攻击 9 只黑猩猩，这一病毒株与 HCV-1 同样属于美国流行的 la 基因型。结果表明，通过 RT-PCR检测，尽管没有一只黑猩猩免于急性感染，但是除了一只以外，其它所有黑猩猩都清除了急性感染并且没有进入慢性感染。相反，绝大多数没有免疫的对照组动物用 HCV-H 攻击后都携带了病毒，说明疫苗可以明显减少慢性的持续感染。这些实验结果表明 gpE1-gpE2 异二聚体疫苗是有效的，提示 HCVEl、E2 包膜蛋白可能是 HCV 疫苗的必须成分。利用来自于HCV-1 的NS3-4-5-核心蛋白免疫五只黑猩猩，能够诱导广谱(针对准种)的CD4+和 CD8+T 细胞反应（17）。但是利用异源的 HCV-H 进行攻击，结果表明，在缺乏抗包膜蛋白抗体的情况下，不能使五只黑猩猩免于异源的 HCV-H 的攻击。这一结果可能是由于免疫方法或免疫原没有充分诱导细胞免疫，而不是由于缺乏抗包膜蛋白抗体，因为细胞免疫反应对急性感染的清除并不依赖于抗包膜蛋白抗体的存在。这一结果也表明了能够同时诱导产生抗包膜蛋白的中和性抗体以及诱导广谱(针对准种)的 CD4+和 CD8+T 细胞反应的疫苗组成可能更为有效。尽管这一次试验失败了，但从另一方面也说明了进入临床研究之前利用黑猩猩攻击模型进行试验的必要性。核心蛋白抗原是 HCV 疫苗的候选靶目标之一。该蛋白不仅是不同基因型 HCV 中序列最保守的蛋白质。即便 HCV 患者体内存在很强的 CTL 反应的条件下，HCV 核心蛋白基因中也没有检测到突变。而且研究表明该蛋白可以诱发理想的体液免疫及细胞免疫应答。目前，利用 ISCOMATRIX作为佐剂的核心蛋白已经进入 I 期临床试验，在猴和健康人体内能诱导针对核心蛋白内保守表位的 CD4+和 CD8+反应（18），因此，它可以作为理想的靶位点。AnneM（19）等在研究中发现所有感染 HCV 后能够自发清除病毒的患者均产生了针对 NS3蛋白的多特异性 CD4+T 细胞反应，多数患者产生了 CD8+T 细胞反应，提示该区抗原可用来设计诱导激活 CD4+、CD8+T 细胞。Sven 等（20）用复制子系统将 HCV 的 NS3 基因导入树突细胞(DC)，在小鼠体内交叉启动 CD8+T 细胞免疫，从而使外源 DC 呈递的抗原成分经 MHCI 类途径有效激发CD8+T 细胞应答。Wen 等（21）等将 Hcv 核心基因和 Ns3 基因用腺病毒导入 DC，发现核心蛋白和 NS3 蛋白能够在 DC 中表达，并能引起自体的淋巴细胞增殖。核酸疫苗除了蛋白疫苗，人们还开展大量关于 DNA 疫苗的研究。与传统蛋白质疫苗相比，DNA 疫苗的最大特点是可表达经过程序化的蛋白,并且是由宿主的 APCs 表现出来,只要将组织相容性复合物结合到脂肽片段上,就可以诱导出 CD4+和 CD8+T 细胞反应。此外,被表达的蛋白以一种适当的形式分泌,产生高水平抗体。该疫苗不但可产生中和抗体,还会对感染有抵御作用,并且也是一种预防性疫苗。DNA 本身具有免疫佐剂的作用，并且可以长期稳定表达抗原，为迅速变异的病原微生物提供长久的交叉保护作用，特别适合于高度变异的 HCV、HIV、流感病毒等疫苗的研究，因而具有重要的理论意义及应用价值。表达 HCV 核心蛋白的质粒在 BALB/c 小鼠中可以产生很强的 CTL 反应。Zhu（22）等研究了以 HCV E1,E2 基因构建的重组质粒免疫 BALB/c 小鼠的免疫效果。结果表明，3 次免疫后，所有小鼠均出现了抗El、E2抗体，抗El抗体滴度最高可达1:320，而抗E2抗体滴度最高可达1:1280，免疫后小鼠的 IFN-γ的分泌也显著高于对照组。Tedeschi 等构建了E2 重组DNA表达载体，免疫 12 只 BALB/c 小鼠后，通过免疫荧光法检测到 E2 蛋白的表达，于免疫后第 2 周开始可检测到抗-E2 抗体(10/12)，第 5 周加强免疫后抗体水平持续升高，并至少维持 8 周，而未加强免疫的抗体滴度则很快降低。虽然 E2 质粒疫苗不能在黑猩猩模型中产生清除病毒的免疫反应，但它能够防止慢性肝炎的发展。抗 HCV 非结构蛋白：S3、NS4 和 NSS 的 DNA 疫苗能在 BALB/c 小鼠中诱发 CD8+CTL 反应。不同形式的 HCV NS3DNA 疫苗在 HLA-A2.1 转基因小鼠模型体内诱导免疫反应。表达 NS3 与溶酶体相关膜蛋白组成的融合蛋白的质粒能够诱导产生很强的 CTL 效应，并且持续很长时间。该模型也可用来检测 HCV NS3 转化的减毒鼠伤寒沙门氏菌的口服疫苗。这种方法可以诱导产生强的细胞毒和分泌 IFN-γ的 CD8+T 细胞。目前针对 HCV 的 DNA 疫苗还存在许多问题，包括：肌肉注射 DNA 后抗原的表达水平很低，缺乏有效的抗原呈递，许多病毒蛋白的免疫原性很低，以及病毒表位的高突变率。为了解决这些问题，不仅要提高载体的表达效率，而且需要应用能够增强免疫反应的免疫刺激元件。为了提高疫苗的免疫效果，一些免疫方案仍处于不断研究之中，其中包括表位修饰，联合应用细胞因子、化学因子以及协同刺激分子作为疫苗佐剂，阻断抑制宿主免疫反应的通路等。病毒样颗粒疫苗病毒样颗粒(VLP)极大程度地模拟了天然病毒体的特性,包括相似的形态、构象、理化特性和抗原特性,已成为候选的重组蛋白疫苗研究热点之一。在昆虫细胞中合成的乳头瘤病毒VLP和轮状病毒VLP 在免疫动物体内不仅能诱导产生高滴度中和抗体,而且能诱生很强的细胞毒性T 细胞(CTL)应答,动物试验显示能提供保护性免疫。因此,丙型肝炎病毒 VLP(HCV-L P)在昆虫 Sf9 细胞内的合成及其良好的免疫原性,给 HCV 疫苗的研制带来了信心和希望。Baumert 等（23）用纯化的 HCV-LP 1b 作为包被抗原,用 ELISA 方法研究发现 HCV-LP 能和不同基因型(16 型)HCV 感染的慢性丙型肝炎患者血清反应,滴度高达 16000 64000。Xiang 等（24）研究显示 HCV-LP 能与 19%抗体检测阴性但 RNA 阳性的丙型肝炎患者血清反应。因此认为以 HCV-LP 作为捕获抗原建立的 EL ISA 在实验室诊断急慢性丙型肝炎和预测干扰素疗效等方面可能有辅助作用。HCV-LP 免疫BALB/c 小鼠后发现如下特点：能诱导很强的体液免疫应答,产生的抗C 和E2 蛋白抗体能与不同基因型 HCV 的对应蛋白反应（25）。抗体的产生存在明显的抗原剂量依赖性。VL P 通过 MHCI 类途径,诱导产生了抗 HCV 的细胞免疫应答,包括特异性 CTL 应答和Th 应答（26）。HCV-LP 免疫小鼠的脾细胞经 C 蛋白刺激能引起强烈的淋巴细胞增殖反应,而E1 和E2 蛋白对淋巴细胞增殖作用较弱。分别用稳定表达HCV C 蛋白或E1 或E2蛋白的P815 细胞作为靶细胞测定 HCV-LP 免疫鼠中的特异性CTL 杀伤活性,证实 E2 蛋白诱导 CTL活性能力最强。加热变性的 HCV 2L P 诱导的体液和细胞免疫应答很弱,表明其免疫原性依赖于颗粒构象。含和不含 p 7 蛋白的 HCV-LP 诱导的体液免疫应答基本相同,但诱导细胞免疫应答能力后者较前者强。初步表明 p 7 蛋白有调节 TH1 和 TH 2 型应答的功能。佐剂 1668p t(含 CpG基序的寡核苷酸)和 DC2Cho l(阳离子脂类胆固醇复合物)单独或者联合使用均不能显著加强 HCV-LP 的免疫原性。但 Qiao 等（27）的研究则显示使用佐剂 10105(含 CpG 基序的寡核苷酸)或 AS01B(单磷酰脂类 A 与 QS21 的复合物)均能增强 HCV-LP 的免疫原性,如果两者联合使用还可发挥协同作用,使 HCV-LP 的免疫效果更好。CTL 表位疫苗HCV 急性感染后，机体针对病毒产生了由中和抗体、CD4+Th 细胞和 CD8+CTL 介导的适应性免疫反应，但是仍然缺乏有效的保护性免疫，使多数患者转成慢性感染。由于 HCV 包膜蛋白的高度变异，使产生的中和抗体难以有效地阻止和清除病毒感染，从而使得细胞免疫的作用尤为突出。人体感染 HCV 后，大多数人的细胞免疫应答很弱，因此发展为慢性肝炎，但是也有少数人的细胞免疫应答较强，可以清除病毒，完全康复（28）。越来越多的研究表明，特异性的 CTL反应在清除 HCV 和组织病毒传播中起到最关键的作用。因此，HCV 的 CTL 免疫表位研究和利用将对预防和治疗性 HCV 疫苗的研制起到关键作用。在 HCV 基因组中，C 区基因最为保守，抗原表位较为集中，刺激产生的应答最强，是 HCV疫苗的必须组份。核心区存在多个不同 HLA(人类白细胞抗原)限制性 CTL 表位，主要集中在氨基端。报道最多的是（29）A2 限制性 3534aa，9098aa，132140aa。HCV E 区存在中和抗原表位，是产生体液免疫的关键区域，但 HCVE2 区存在高变区(HVRI)。因此在研制针对 E 区产生中和抗体为主的预防性疫苗的研究一直进展缓慢。HCV 非结构区存在多个优势 CTL 表位，尤其是 HLA-A2 限制性的 CTL 表位，经多种方法(四聚物染色分析、ELISPOT 以及 HCV 患者的 PBMC与合成肤的细胞毒分析实验等)证实，在诱导特异性的细胞免疫应答方面起重要作用。展望丙型肝炎疫苗是预防 HCV 感染的关键，但目前的候选蛋白质疫苗、DNA 疫苗等尚多不能证实具有理想的保护作用。继续寻找 HCV 保护性 B 细胞及 T 细胞表位，深入探索 HCV 的致病机制将是制备有效丙型肝炎疫苗的基础。目前认为，理想的 HCV 疫苗应具有双重功能：1，可以产生交叉活性的体液免疫反应以中和感染的病毒准株；2，能够诱导产生强大的 CTL 免疫反应，清除逃过抗体中和反应的病毒株。由于 HCV 的高变异性以及结构抗原和非结构抗原均无法诱导有效的全面免疫应答。因此组合多个抗原表位并加以合适的佐剂以增强多表位疫苗的免疫效果，体液免疫和细胞免疫应答，将成为 HCV 疫苗研制的重要发展趋势。