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中国结核病防治规划 痰涂片镜检实验室质量保证手册 二五年十月 痰涂片镜检实验室质量保证手册 检验星空特别版 第 1 页 共 40 页 术语注释术语注释 质量保证（质量保证（Quality Assu urance ，QA ）是能持续提高实验室服务效率和可信度的体系，包括室内质量控制、室间质量评估和质量提高。 质量控制（质量控制（Quality Control ，QC ） 也称室内质量控制。包括结核病痰涂片操作镜检实验室质量控制的所有方法，如仪器和染色液的检查等。 室间质量保证 （室间质量保证 （External Quality Assessment ， EQA） 是根据与其他网络实验室 （中间级实验室和中心实验室） 比较批量检测和盲法复检结果评价基层实验室能力的过程。 EQA包括实验室现场评估以评价操作质量并且也包括现场对涂片的复读。EQA 是 IUATLD 描述的熟练度检测的扩大。 质量提高（质量提高（Quality Improvement ，QI） 是通过分析痰涂片镜检诊断服务的各组成部分，寻找能永久清除障碍成功的过程。数据收集、分析、创意思路都是这一过程的重要部分。 它涵盖了连续监测、 明确缺陷及后续改正措施， 如必要时重新培训以杜绝问题再次发生。QI 常依赖于有效的现场评估访视。 现场评价（现场评价（On-site evaluation） 国家或地区结核病规划下的地区督导员的常规对下级实验室的督导检查和高水平实验室督导员的年度督导检查。 批量检测 （批量检测 （Panel Testing） 把已染色和/或未染色涂片从中心或国家参比实验室送到外围或中间级实验室以检查读片和报告的过程。 批量检测和世界卫生组织定义的熟练度检测是等同的。 盲法复检（盲法复检（Blinded-Rechecking） 把涂片从外围实验室送到参比实验室（中间级或中心实验室）再次读片。指南推荐采用盲法复查，确保控制方事先不知道外围实验室的检查结果。其他文件中，这也被称做复读。 涂片阳性率（涂片阳性率（Slide positivity rate ，SPR） 在一定时间内一个实验室所有受检涂片（诊断或监测涂片）中阳性涂片的比例。 高假阳性（高假阳性（High False Positive ，HFP） 阴性片被错误地判读为 24阳性。 高假阴性（高假阴性（High False Negative ，HFN） 24阳性涂片被错误地判读为阴性。 量化误差（量化误差（Quantification Error，QE） 同一张阳性涂片受检方和控制方阳性判断级别的差异。 低假阳性（低假阳性（Low False Positive ，LFP） 阴性涂片被错误地判断为低阳性（1以下） 。 低假阴性（低假阴性（Low False Negative ，LFN） 低阳性（1以下）涂片被错误地判断为阴性。 痰涂片镜检实验室质量保证手册 检验星空特别版 第 2 页 共 40 页 第一章第一章 绪论绪论 为了进一步加强结核病控制工作， 实现全国结核病防治规划目标， 加强直接面视下短程化疗的技术策略和结核病细菌学实验室质量控制， 提高肺结核病人的发现率， 通过实验室细菌学诊断传染性肺结核是实施 DOTS 策略的一个关键，而且对结核病控制项目的成功起着重要的影响作用。因此，在执行国家结核病防治规划中必须具备有效的结核病实验室网络。一个可信的实验室必须符合成本-效益原则，并且提供准确的实验结果，为此只有通过质量保证（Quality Assurance ，QA）才能实现。结核病实验室质量保证的一个重要组成部分就是室间质量评估（External Quality Assurance ，EQA） ，即由上级参比实验室通过一系列的规范性活动来监督， 不断完善实验室的质量保证程序， 其质量保证有赖于国家结核病控制规划对各级实验室检查工作的支持、培训和监督，并逐步完善与国际接轨的质量保证管理系统。 第一节 目的和任务第一节 目的和任务 在结核病控制工作中痰结核菌检查对发现传染源、确定诊断和化疗方案、考核疗效、评价防治效果具有重要意义。因此，结核病细菌检查是国家结核病控制规划（NTP）的重要组成部分，在现代结核病控制工作中起着不可缺少的重要作用。 第二节 实验室网络及职能第二节 实验室网络及职能 一、实验室网络及职能一、实验室网络及职能 图图 1：实验室室间质量评估网络图：实验室室间质量评估网络图 （一）国家参比实验室（一）国家参比实验室 1. 制定我国各级结核病实验室痰涂片质量保证指南与实施细则。 2. 收集、整理、统计、分析国家室间质量保证信息资料。 3. 组织培训国家级质控督导员。 4. 计划、实施对下级实验室的定期督导检查。 痰涂片镜检实验室质量保证手册 检验星空特别版 第 3 页 共 40 页 5. 指导、协调、评估各省（直辖市、自治区）参比实验室室间质量保证工作。 6. 开展我国结核病实验室室间质量保证方法的实施性研究。 （二）省级参比室（二）省级参比室 1. 根据国家参比室和省结核病控制规划的需要，制定本省痰涂片室间质量保证实施计划。 2. 收集、整理、统计、分析省内室间质量保证信息、资料，按要求定期上报国家参比实验室。 3. 省级参比实验室负责省内质量保证的技术支持与培训；组织、协调、评估本省各市、县实验室室间质量保证工作。 4. 负责地（市）级和县级结核病实验室的现场评价(on-site evaluation) 、批量检测（Panel Testing） 、随机抽样和委托初次复验者盲法复检。 5. 承担地（市）级结核病实验室盲法复检的再次复验者复检工作。 6. 指导、监督地（市）级实验室实施县级实验室室间质量保证工作。 （三）地（市）级结核病实验室（三）地（市）级结核病实验室 1. 根据国家参比室和省参比室的要求，制定本地区痰涂片室间质量保证实施计划。 2. 收集、整理、统计、分析本地区内室间质量保证信息资料，定期上报省参比实验室。 3. 负责辖区内结核病实验室质量保证的技术支持与培训；组织、协调、评估各县实验室的室间质量保证工作。 4. 做好本实验室痰涂片镜检和室内质控工作，接受省参比室定期室间质量保证督导。 5. 承担同级间实验室（地、市）初次复验者盲法复检工作。 6. 负责实施县级结核病实验室的现场评价、 批量检测、 盲法复检和再次复验者的复检工作。 （四）县级结核病实验室（四）县级结核病实验室 1. 做好本实验室痰涂片镜检和室内质控工作，接受上一级参比室定期室间质量保证督导。 2. 承担同级间实验室（县级）初次复验者盲法复检工作。 第二章第二章 痰涂片检查痰涂片检查 第一节第一节 痰涂片的意义痰涂片的意义 在当前国家结核病控制措施的框架下，抗酸杆菌（acid-fast bacilli，AFB）镜检的目的是： 一、传染性结核病的诊断指标：目前，控制结核病流行以发现和控制传染源为主。现在认为，痰涂片 AFB 阳性的肺结核患者是传染源，对未经细菌检查证实的肺结核患者成为“可痰涂片镜检实验室质量保证手册 检验星空特别版 第 4 页 共 40 页 疑肺结核患者” ；故痰涂片 AFB 镜检结构对诊断传染性肺结核是一项重要指标。 二、评价传染性结核病的化疗效果：由于目前结核病的药物化疗方案，其原理主要是根据结核分枝杆菌的生物学特征而制定的，所以对化疗效果的评价，也必须以 AFB 细菌学检查结果作为根据。 三、 为结核病疫情的流行病学统计服务： 由于传染性结核病在流行病学中有着特殊的意义，因此，在反映某一国家或地区结核病疫情的严重程度的指标中，涂阳患者率、涂阳发病率被更多关注。 根据世界卫生组织（WHO）和国际防痨及肺部疾病联合会（IUATLD）针对低收入且结核病疫情严重的发展中国家所制定的技术指南，痰涂片 AFB 镜检是相应国家开展结核病控制项目时， 非常符合成本效益原则的细菌实验技术， 相对于临床和实验室经常采用的其它诊断和检查项目，高质量的 AFB 镜检方法有其特有的优势： 1. 作为诊断手段，对传染性肺结核的诊断比 X 线的准确性高； 2. 作为实验方法，技术相对简单，容易标准化和完成操作 3. 建立 AFB 检查时所需设备投入少； 4. 检查成本低，易于接受； 5. 从受到标本到报告结果的时间短，能够满足临床诊断的需要； 6. 对菌阳患者的治疗效果，能够作为及时和准确的评价。 第二节第二节 分枝杆菌的形态和结构分枝杆菌的形态和结构 一、分枝杆菌的形态 当患者标本直接进行涂片镜检时， 能够发现不同的分枝杆菌形态变化较多。 结核分枝杆菌多数为杆状、稍弯曲；菌体宽度 0.30.6m；菌体长度不一，在 0.58m 之间，多数在1.53.5m；少数菌体较长者可呈螺旋状；染色良好的结核分枝杆菌菌体内，能够发现着色较深的异染颗粒， 含结核分枝杆菌较多的新鲜标本经萋尔-尼尔逊染色 （Ziehl-Neelson， Z-N，简称萋-尼氏染色） ，100油镜观察，能够发现单个存在的细菌、也能看到聚集成簇或分枝状排列的细菌，多数非结核分枝杆菌（non-tuberculosis mycobacteria，NTM）的形态较结核分枝杆菌短且粗，呈棒状、短棒状甚至颗粒状。 培养生长的菌落经生理盐水研磨、 悬浮物稀释后涂片镜检， 结核分枝杆菌的形态较标本直接涂片的稍短且粗，常聚集而形成“索状” ；经培养的 NTM 菌体形态与临床标本中的比较变化不大、且较少聚集。 二、结核分枝杆菌的结构 痰涂片镜检实验室质量保证手册 检验星空特别版 第 5 页 共 40 页 分枝杆菌由于细胞结构和细胞成分的特殊性， 具有经碱性染料染色后， 能够耐受酸性介质脱色的特征，具备相应染色特征的细菌习惯上被称为抗酸菌（acid-fast bacillus，AFB） 。目前，除结核分枝杆菌以外（临床上最为常见的分枝杆菌） ，发现的分枝杆菌种类已达 100余种。当然，除分枝杆菌以外，还有少数细菌具有抗酸染色的特征。 AFB 菌体细胞结构的完整性与其抗酸染色特性有着密切联系。通过电子显微镜观察分枝杆菌，完整的细胞结构主要有以下部分组成： （一）细胞壁：分内、中、外三层；外层细胞壁的主要成分分枝菌酸，是造成分枝杆菌细胞抗酸染色特性的主要成分， 中层细胞壁的只要成分有肽脂糖和磷脂蛋白， 内层细胞壁的主要成分是多糖体， 分枝杆菌细胞壁的组分和结构的完整性， 对相应细菌的抗酸染色特性起到关键作用。 （二）细胞膜：主要由脂蛋白组成。部分细胞膜通过折叠、卷曲，能够形成层状结构被称为中介体（或间体）的细胞器。 （三）细胞质：本身致密性交叉。 （四）核区：因遗传物质 DNA 和参与表达的 RNA 较密集而成。 （五）细胞器：有主要成分为甘油三酯、抗酸染色的能力较差的脂质空泡，和主要成分是聚磷酸盐、具有较强的抗酸脱色性的异染小体（异染颗粒）等。 第三节第三节 检查对象检查对象 根据国家结核病防治规划指南的有关规定，检查对象根据检查目的分为两类： 一、确定诊断：凡因结核病症状求诊及转诊的可疑结核患者，均应进行直接涂片检查。一般包括持续咳嗽、咳痰超过 3 周；咯血或伴有血痰；发热或胸痛超过 2 周；胸部 X 线异常。 确定诊断的涂片检查应采集 3 个合格的痰标本。 就诊当时在门诊留一份 “即时痰” 标本，同时给患者 2 个痰盒，嘱患者留取“夜间痰”和“晨痰” ，于次日交验。 二、疗效评价：凡已确诊、登记、治疗的肺结核患者，在化疗期间按照规定应定期查痰： （一）初次涂阳患者在疗程强化期末、继续期满 3 个月和继续结束时，复治涂阳患者在疗程强化期末、继续期满 3 个月和继续期结束时，各查一次晨痰。 （二）初、复治涂阳患者在疗程强化期接受时，痰菌仍为阳性者，应在 1 个月时增加晨痰检查一次； 若复治涂阳患者治疗满 3 个月时痰菌仍阳性， 应在治疗满 5 个月增加晨痰检查一次。 （三）确诊、登记的涂阴肺结核患者，即使患者因故未接受治疗，也应在登记后满 2和 6 个月时进行痰菌检查。 痰涂片镜检实验室质量保证手册 检验星空特别版 第 6 页 共 40 页 第四节第四节 痰标本的采集痰标本的采集 一、标本采集： （一）用于采集标本的容器：采用 WHO 推荐的国际通用螺旋盖痰瓶（见图 2），或可密封塑料盒、蜡纸盒收集痰标本（参考规格：直径 4cm，高 2cm）。痰容器上应标明病人的姓名、编号（初诊病人门诊序号或随访病人登记号）、检查项目、容器序号 1、2、3（1当日即时痰，2夜间痰，3次日晨痰）。 图图 2 标本容器标本容器 （二）标本的性状： 合格的痰标本应是患者深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物。 1、干酪痰：标本外观以黄色（或奶酪色）脓样、团块状的肺部分泌物为主，粘度较粘液痰低，制片时较易涂抹；涂片染色后镜检，可见大量脓性炎症细胞、肺上皮脱落细胞。由于此类标本是由肺部深处咳出，对肺结核的诊断最有价值，故 AFB 的检出率较高。 2、血痰：此类标本是因粘液痰或干酪痰标本中混有血液而形成，颜色为褐色或深褐色、鲜红色或伴有血丝； 涂片染色后镜检除能够观察到粘液痰或干酪痰的细胞特征外， 含新鲜血液的标本中还可见到被染色的红细胞。由于含血标本易干扰 AFB 镜检的结果，故在制片时应尽量避免挑取含血标本。 3、粘液痰：标本外观以白色、粘稠度较高的肺部和支气管分泌物为主，制片时需仔细涂抹；涂片染色后镜检时，镜下可见支气管内膜纤毛柱状上皮细胞（细胞较长且形态不规则、细胞核和细胞质着色均较深， 细胞一端可见着色较浅的纤毛） ， 伴有少量肺上皮脱落细胞 （多数为圆形，细胞核较小，且着色较细胞质深，核质比1:3）、脓性炎症细胞（卵圆形、细胞核占细胞比例较大且着色较深，核质比1:1）、口腔脱落细胞及口腔寄生菌。此类标本的 AFB 检出率较唾液高。 4、唾液：目视观察标本外观，以透明或半透明水样、粘度较低的口腔分泌物为主，标本中有时伴有气泡；涂片染色镜检时，镜下可见少量口腔上皮脱落细胞（形态不规则、细胞核 痰涂片镜检实验室质量保证手册 检验星空特别版 第 7 页 共 40 页 着色较细胞质深，核质比接近或1:2）和口腔内寄生菌，有时可见食物残渣。由于此类标本进行 AFB 检查时的检出率很低，用于患者确定诊断时是不合格的标本。 （三）标本采集： 根据痰标本采集的时间，可将标本分为三类： 即时痰：就诊时深呼吸后咳出的痰液。 晨痰：患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第 2 口、第 3 口痰液。 夜间痰：送痰前一日，患者晚间咳出的痰液。 进行 AFB 检查的医疗机构应提供符合要求的标本收集容器，医务人员在容器上应注明患者姓名、编号（门诊序号或登记号）、检查项目、痰标本序号，然后交给患者。 对疑似肺结核病者， 临床医护人员应通过解释， 使其充分了解标本质量对相应检查项目的重要性，示范并指导其掌握从肺部深处咳痰的方法；如患者识字，可提供宣教材料。（注意：由于当患者咳嗽、咳痰时，易于产生含有结核菌的气溶胶，感染周边人群的机率较高，故采集痰标本时应在远离人群的开放空间进行，或在通风良好的室内进行。） 患者留取的痰标本， 应由检验人员或经培训的专人目视检查标本质量 （特别是用于初次诊断的痰标本）：标本量一般在 35ml，标本性状属于干酪痰、褐色血痰或含少量新鲜血液的血痰、 粘液痰者为合格的标本； 痰标本不合格者， 应予以进一步指导并要求其重新送检。进行细菌学检查时，应在登记本和检验报告单上注明标本性状，以供分析结果时参考。 第五节第五节 涂片抗酸染色检查方法涂片抗酸染色检查方法 抗酸染色的基本原理： 抗酸菌具有耐受酸性介质脱色的生物性状， 此类细菌在石炭酸 （苯酚） 的协同作用下， 被复红染色剂着色， 能够耐受酸性酒精脱色， 显微镜观察时保持紫红色；而其它脱落细胞或标本中的非抗酸菌被酸性酒精脱色后，可被复染剂亚甲蓝染为蓝色。 一、玻片的制备： （一）用于 AFB 检查的载玻片要求： 1. 一张载玻片上只能涂抹一份痰标本。 2. 每张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于 AFB 涂片检查； 3. 应使用以 95%乙醇擦拭（浸泡）脱脂，经干燥、清洁、无油污、无划痕的新玻片制备涂片， 在玻片背面一端的 1/3 处注明实验室序号及标本序号 （如使用的载玻片一端无磨砂面，必须使用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可用 2B 铅笔在磨砂面上直接书写）。 痰涂片镜检实验室质量保证手册 检验星空特别版 第 8 页 共 40 页 （二）制备涂片：小心打开留取痰标本的容器，防止产生气溶胶或使标本外溢（最好在超净工作台中操作）。仔细观察标本，使用折断的竹签茬端，挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分约 0.050.1ml，于玻片正面右侧 2/3，处均匀涂抹成 10mm20mm 的卵圆形痰膜。痰膜朝上静置，自然干燥后（一般约需要 30 分钟）进行染色镜检。 涂抹完毕后的痰标本，在报告结果前应暂时保留。 为保证检验人员的安全，严禁在涂抹痰标本的同时，对载玻片进行加热。 二、萋尔尼尔逊染色法（Ziehl-Neelson，Z-N，简称萋尼氏染色）： （一）试剂的配制 1石炭酸复红染液： （1）储存液 碱性复红液：碱性复红 8g，加 95%乙醇至 100ml，充分振荡使复红溶解。 碱性复红乙醇储存液应避光保存，为保证染液的质量，建议储存液保存不超过 6 个月。 5%石炭酸水溶液：4050水浴加热石炭酸使之融解，取液态石炭酸 5g 溶于 90ml热蒸馏水中，待溶液冷却至室温时，补充蒸馏水至 100ml。 （2）石炭酸复红工作液：经定性滤纸过滤的碱性复红储存液 10ml 与 5%石炭酸水溶液 90ml充分振荡、混合均匀后，用定性滤纸过滤。 碱性复红 （或称为碱性品红， basic fuchsin， or pararosaniline chloride， 分子式为 C19H18NCl）用于 AFB 染色时，必须使用染料最低含量超过 88%的生物染色剂，合格产品一般在试剂包装上注明相应含量。如果标注的染料含量低于 88%，则在配制时需调整称取量。例如，染料含量标注为 75%的产品，配制 100ml 储存液时实际的称取量应是 8/0.75=10.7g。 石炭酸（苯酚，phenol，分子式为 C6H6O）:应使用熔点为 40.5的分析纯试剂。 25%盐酸乙醇脱色液： 35%浓盐酸 5ml 与 95%乙醇 95ml 混合。 3亚甲蓝复染液： （1）储存液：亚甲蓝 0.3g 溶于 95%乙醇 50ml 中，完全溶解后加蒸馏水至终体积 100ml。 （2）亚甲蓝复染液： 以蒸馏水 5 倍稀释 0.3%亚甲蓝储存液，经充分振荡、混合均匀后，亚甲蓝的终浓度为0.06%，使用定性滤纸过滤，即得亚甲蓝染液。 亚甲蓝（methylene blue chloride，or methylthionine chloride，分子式为 C16H18ClN3S）：染色时必须使用染料含量超过 82%的生物染色剂。 痰涂片镜检实验室质量保证手册 检验星空特别版 第 9 页 共 40 页 4萋尼氏染色步骤： 1. 涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持 10mm 以上的距离；火焰固定（在 5秒钟内将玻片置于火焰上烤 4 次）。 2. 滴加石炭酸复红染液，盖满痰膜，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色 5 分钟。染色期间始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加温时勿使染色液沸腾。 3. 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。 4. 自痰膜上端外缘滴加脱色剂布满痰膜，脱色 1 分钟；如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。 5. 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。 6. 滴加亚甲蓝复染液，染色 30 秒钟。 7. 流水自玻片一端轻缓冲洗， 冲去复染液， 然后沥去标本上剩余的水， 待玻片干燥后镜检。 一张染色合格的玻片，由于被亚甲蓝染色而呈亮蓝色。将染色后的玻片放置在报纸上，如果透过痰膜不能分辨报纸上的文字，表明该玻片涂抹过厚。 三、荧光染色法： AFB 采用荧光染色法镜检，只限于那些日常工作量较大（日读片数超过 25 张）、具备荧光显微镜、且镜检人员阅读荧光染色玻片具有丰富经验的实验室开展。 （一）试剂配制 1. 染色剂（金胺 O 染液） 金胺 O 1 g 石炭酸 50 ml 乙醇 100 ml 补蒸馏水至 1000 ml 金胺 O（auramine O，分子式为 C17H21N3HCl）：用于 AFB 染色时必须使用最低染料含量约 80%的生物染色剂。 2. 脱色剂：3%盐酸乙醇（配制方法参照萋尼氏染色）。 3. 复染剂：0.5%高锰酸钾水溶液。 （二）染色步骤： 1. 玻片经火焰固定，滴加染色剂盖满玻片，染色 30 分钟；流水自玻片一端轻缓冲洗，洗去染色液，沥去玻片上剩余的水。 痰涂片镜检实验室质量保证手册 检验星空特别版 第 10 页 共 40 页 2. 自痰膜上端外缘滴加染色剂，布满痰膜，脱色 3 分钟或至无色，流水自玻片一端轻洗，洗去脱色剂。 3. 滴加复染剂复染 2 分钟，沥去复染剂，自然至干燥，准备镜检。 四、镜检读片： （一）萋尼氏染色玻片镜检 使用 10目镜双目显微镜读片。取染色完毕且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片台上并以卡尺固定。首先使用 40物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当亮度，调节焦距至可见细胞形态；移开 40物镜，在玻片上滴 12 滴镜油，使用 100油镜进行细致观察。在淡蓝色背景下，抗酸菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色。为防止 AFB 的交叉污染，严禁油镜镜头直接接触玻片上的痰膜。 由于香柏油（cedarwood immersion oil）能溶解复红染料，使萋-尼氏染色退色，并且容易干燥凝结，对油镜头造成损害，故推荐使用专门用于 100油镜、不干燥、不变硬的镜油（immersion oil）。 读片时，首先应从左向右观察相邻的视野，当玻片移动至痰膜一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依此类推。通常 10mm20mm 的痰膜，使用 100油镜，每行可观察约 100 个视野。 仔细观察完 300 个视野，一般需要 5 分钟以上；每个工作日，一位镜检人员的玻片阅读量不要超过 25 张，且连续阅读 1012 张玻片后，应休息 20 分钟左右。 图图 3 镜检读片移动方式镜检读片移动方式 （二）荧光染色玻片镜检： 玻片放置在载片台上并以卡尺固定后，首先以 10目镜、20物镜进行镜检，发现疑似为AFB 的杆状荧光颗粒时，使用 40物镜确认。在暗背景下，抗酸杆菌发出杆状荧光。 痰涂片镜检实验室质量保证手册 检验星空特别版 第 11 页 共 40 页 相应波长光线激发染料产生可视光的能力， 随着时间而衰减。 故荧光染色后的涂片应于当日镜检；如果玻片数量过多，应将涂片放置于 4避光保存，次日必须完成镜检。 五、镜检结果报告： 由于与疾病传染性的程度及其相应严重程度密切相关， 故镜检时发现细菌的数量是非常重要的参考依据。因此痰涂片镜检的结果报告，不仅是对疾病的定性，也是对疾病严重程度的半定量。 （一）萋尼氏染色镜检结果分级报告标准： 抗酸杆菌阴性（）：连续观察 300 个不同视野，未发现抗酸杆菌。 报告抗酸杆菌菌数：18 条/300 视野。 抗酸杆菌阳性（1+）：39 条/100 视野。 抗酸杆菌阳性（2+）：19 条/10 视野。 抗酸杆菌阳性（3+）：19 条/每视野。 抗酸杆菌阳性（4+）：10 条/每视野。 （二）荧光染色镜检结果分级报告标准： 荧光染色抗酸杆菌阴性（）：0 条/50 视野。 荧光染色报告抗酸杆菌阳性（报告抗酸菌数）：19 条/50 视野。 荧光染色抗酸杆菌阳性（1+）：1099 条/50 视野。 荧光染色抗酸杆菌阳性（2+）：19 条/每视野。 荧光染色抗酸杆菌阳性（3+）：1099 条/每视野。 荧光染色抗酸杆菌阳性（4+）：100 条/每视野。 六、抗酸染色玻片的保存： 阅读完萋尼氏染色玻片后，应及时用浸满二甲苯（分析纯）的擦镜纸揭取数次，彻底去除玻片上的镜油。经脱油、干燥后的玻片，按实验室序号及涂片编号放置在玻片盒中，存放在阴凉干燥的环境中，以备复检或质控抽检。 荧光染色的玻片，玻片盒中放置干燥剂后密封放置在 4冰箱保存。 荧光染色涂片质控时，应首先将复检涂片进行萋尼氏染色后，重新阅读。 七、痰涂片抗酸染色检查注意事项 （一）AFB 痰检假阳性结果的预防措施 1. 必须使用新的载玻片进行痰涂片检查。 2. 每个标本均使用一个新竹签完成制片涂抹。 痰涂片镜检实验室质量保证手册 检验星空特别版 第 12 页 共 40 页 3. 所有染液均经过过滤。 4. 染色时玻片彼此之间保持一定距离，相互彻底分隔开。 5. 严禁使用染色缸将玻片放置一起染色。 6. 染色时勿使玻片上的染液干燥。 7. 滴加镜油时，严禁容器滴口直接接触玻片痰膜。 8. 严禁物镜镜头直接接触玻片痰膜。 9. 完整、准确的标注痰盒、玻片和实验室登记本的各项内容。 10. 登记前、后对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。 11. 准确记录和报告结果。 （二）AFB 痰检假阴性结果的预防措施 1. 确认标本是痰而非唾液。 2. 确认每份标本至少有 3 ml。 3. 选择脓样、干酪样、粘液分泌物涂抹制备玻片。 4. 制备玻片时标本涂抹均匀，不要太厚或太薄。 5. 使用高质量染料、严格按照配方配制染液。 6. 严格按照操作程序完成染色过程。 7. 判断结果为“阴性”前，必须阅读规定要求的视野数。 8. 作为对照，可采用已知结果为阳性的玻片，完成染色镜检过程。 9. 完整、准确地标注痰盒、玻片和实验室登记本。 10. 登记前对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。 11. 准确记录和报告结果。 第六节第六节 涂片抗酸染色检查材料管理涂片抗酸染色检查材料管理 一、显微镜日常维护 显微镜作为发现涂片阳性病人的重要设备， 实验室工作人员应正确使用并给予正确维护， 以保证其正常工作和延长使用寿命。在使用和维护显微镜时应特别遵守下列要点： 1. 显微镜应放置在干燥、无尘和通风的环境中。如果显微镜一段时期内停止使用，应拆开并放置在原包装盒内，并放置有效的干燥剂。 2. 使用前和使用后必须使用擦镜纸彻底清洁物镜。 3. 严禁物镜镜头直接接触玻片上痰膜。 4. 使用油镜时，只能使用细螺旋调节焦距。 痰涂片镜检实验室质量保证手册 检验星空特别版 第 13 页 共 40 页 5. 使用电光源显微镜时，注意电压和电流是否与仪器要求相匹配。 二、AFB 镜检耗材管理: 为保障痰涂片检查工作能够连续不断开展， 应储存一定数量的实验耗材和相应试剂， 储备量可根据既往每季度工作量来进行评估，一般应准备比平均工作量高 20%的相应耗材和试剂。每个查痰点每检查 1000 份痰标本所消耗的材料列表如下 表 1 实验室准备耗材 材料、试剂名称 用量 （每检查 1000 份痰标本）备注 痰盒 1100 个 竹签 1100 个 载玻片 1100 张 镜油 110 ml 复红 40 g 金胺 O （如使用荧光染色） 5 g 石炭酸 250 g 亚甲蓝 1.5 g 浓盐酸 500 ml 95%酒精 10000 ml 定性滤纸 6 张 每张玻片染色使用两种染液各约 5ml、脱色液约 10ml 二甲苯 110 ml 擦镜纸 1 本 载玻片盒(100 张/盒) 10 个 盐酸、酒精的消耗量根据脱色情况可能需要调整。 参考文献： 1.全国结核病防治工作手册，卫生部疾病控制司、卫生部医政司编，1999。 2. Technical Guide. Sputum Examination for Tuberculosis by Direct Microscopy in Low Income Coutries.5th edition,IUATLD,2000. 3.The Micoscope.A Practical Guide.WHO Project:ICP TUB 001.New Delhi, India:WHO Regional Office for South-East Asia,1999. 4. Laboratory Biosafety Manual.2nd edition.Geneva:WHO,1993:60-61. 痰涂片镜检实验室质量保证手册 检验星空特别版 第 14 页 共 40 页 附件附件 1：检验单参考样式：检验单参考样式 结防所（科）痰结核杆菌检验单 姓名 性别 年龄 实验序号： (初诊病人)门诊序号： (随访病人)登记号： 痰涂片检查结果： 送检医生： 送检日期： 报告人： 报告日期： 附件附件 2：结核病细菌学实验室登记本：结核病细菌学实验室登记本 痰标本来源 标本镜检结果 实验 序号 日期 姓名 性别 年龄 初诊病人 住址 初诊病人(门诊序号)随访病人(登记号)标本 性质结果日期 签名 备注1 2 3 1 2 3 说明：痰性质按照痰标本为：干酪痰、血痰、粘液痰分别填写，唾液为不合格痰，应嘱病人重新送合格的痰标本。 痰涂片镜检实验室质量保证手册 检验星空特别版 第 15 页 共 40 页 第三章第三章 痰涂片实验室质量保证痰涂片实验室质量保证 按照世界卫生组织（WHO）和国家结核病防治规划（NTP）的要求，在我国已全面推行 DOTS 策略或 DOTS 策略得到良好贯彻执行的地区，为了持续提高结核病实验室痰涂片检查的工作效率和可靠性， 必须建立我国结核病实验室质量保证系统网络， 在实验室内部质量控制的基础上，应用实验室间质量检查和评估方法，进行实验室检查系统的评价，并通过采取一系列措施改经和不断提高实验室业务总体水平。 第一节第一节 室内质量控制室内质量控制 室内质量控制（Quality Control ，QC）是指实验室内部的操作规程、设备和耗材、痰标本收集、染色剂制备、涂片制备和染色、显微镜维护、显微镜镜检、结果登记和报告、以及痰片保存等整个过程中的内部检查和监测。 一、痰标本收集一、痰标本收集 （一）容器：采用 WHO 推荐的国际通用螺旋盖痰瓶，或可密封塑料盒、蜡纸盒收集标痰本（参考规格：直径 4cm，高度 2cm）。痰容器应标明病人姓名、日期、编号（初诊病人门诊序号或随访病人登记号）和容器序号 1、2、3（1当日即时痰，2夜间痰，3次日即时痰）。 （二）痰标本性质：干酪痰、血痰、粘液痰为合格标本；唾液或口水为不合格标本，除照常进行涂片检查外，应要求患者重新送检。 （三）初诊病人应收集 3 份痰标本（当日即时痰、夜间痰和次日晨痰）、治疗中或复诊随访病人安装每次收集 2 份痰标本（当日即时痰、当日或次日晨痰）。 （四）对当日不能进行涂片检查的标本，须置于 4冰箱保存，注意防止痰液干涸或污染。 二、抗酸染色液制备二、抗酸染色液制备 （一）有染色液制备配方和配置记录。 （二）染色液试剂瓶须表明染色液名称、浓度和制备时间。 （三）染色液置于棕色瓶内存放，避光保存。 三、载玻片三、载玻片 （一）新载玻片应经 95%乙醇脱脂，检查无划痕后方可使用。 （二）一张载玻片只能涂抹 1 份痰标本。 （三）载玻片只允许一次使用，严禁清洗后重复使用。 （四）载玻片正面左侧 1/3 处标注实验室序号（如使用的载玻片一端无磨砂面，必须使用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可用 2B 铅笔在磨砂面上直接书写）。 痰涂片镜检实验室质量保证手册 检验星空特别版 第 16 页 共 40 页 （五）载玻片正面右侧 2/3 中央处均匀涂抹成面积为 1020mm 的卵圆形痰膜。 四、染色四、染色 （一）肉眼观察染色后的痰膜应呈均匀亮蓝色，无红色斑块。 （二）将染色后的玻片放置在报纸上，如果透过痰膜不能分辨报纸上的文字，则表明该玻片涂抹过厚。 （三）染色后的痰膜脱离部分应小于整个涂抹面积的 10%。 五、镜检要求五、镜检要求 （一）为防止抗酸菌的交叉污染，严禁油镜头直接接触涂片上的痰膜。 （二）仔细观察 300 个视野。 （三）每个工作日，一名镜检人员的涂片阅读量不应超过 25 张。 （四）连续阅读 1012 张涂片后，应休息 20 分钟左右。 （五）采用自查和互查方式，至少抽查复检当日 10%涂片，并填写室内质控登记表（表 2）。 表表 2 室内质量控制每日涂片抽查复检登记表室内质量控制每日涂片抽查复检登记表 20 年 月 镜检涂片数 日期 合计 阴性 阳性 初检者 签名 抽查复检涂片数 痰涂片符合数 复检者 签名 痰涂片镜检实验室质量保证手册 检验星空特别版 第 17 页 共 40 页 合计 六、登记报告六、登记报告 （一）登记前后应对检验单、标本盒、涂片上的标注进行反复核对。 （二）检查后的每一张涂片结果，应按规定准确记录在“结核病细菌学实验室登记本”上。 （三）镜检结果报告应及时发出，以便尽早为临床提供诊断依据。 七、痰涂片保存七、痰涂片保存 （一）镜检后的涂片应及时用浸满二甲苯（分析纯）的擦镜纸揭取数次，彻底祛除涂片上的镜油。 （二）涂片脱去镜油后，必须再次核对实验室登记本与每张涂片实验序号。 （三）涂片上严禁标记镜检的阴、阳性结果。 （四）全部涂片按实验室登记本序号连续排列，存放于玻片盒内。 痰涂片镜检实验室质量保证手册 检验星空特别版 第 18 页 共 40 页 （五） 涂片保存与实验室登记本记录应一致。 初诊病人每一张涂片存入涂片盒后需预留出两个空位置，以备第二张、第三张涂片检查后放入；随访病人第一张涂片存入涂片盒后需要预留出 1 个空位置，以备第二张涂片检查后放入。 （六）按规定数量保存的用于室间质量评估的涂片，未经上级质控单位准许不能自行销毁。 （七）装满涂片的玻片盒，需用标签注明涂片实验序号区间和日期区间，以便日后盲法复检或现场评价时抽样。 第二节第二节 室间质量评估室间质量评估 室间质量评估是根据与其它网络实验室 （中间级实验室和中心实验室） 比较批量测试和盲法复检结果评价基层实验室能力的过程。EQA 包括实验室现场评估以评价操作质量并且也包括现场对涂片的复读。EQA 是国际肺病和防痨联合会描述的熟练度检测的扩大。 一、现场评价一、现场评价 （一）要求： 1. 现场评价之前首先建立下级实验室技术档案，由被督导实验室填写附件 1 结核病实验室基本情况登记表，每次现场评价时需重新核实登记内容。 2. 国家参比室每年对省级参比室至少进行 1 次现场评价，同时每省至少抽查一个市、县级结核病实验室。 3. 省级参比室每年对所辖市级实验室至少进行 1 次现场评价，同时每地（市）抽查 12个县级实验室；必要时，对批量检测或盲法复检存在问题的市、县实验室，适当增加现场评价频率。 4. 市（地）级实验室每年对所辖县（区）实验室每年至少进行 2 次现场评价。 5. 对批量检测或盲法复检存在问题的县级实验室必须尽快查找原因，提高涂片镜检质量。 6. 现场督导员应由经验丰富的实验室技术人员担任，必须经高一级实验室有资格督导员培训后方可上岗。 7. 现场评价要按本操作细则所列项目顺序进行，评价结果可结合当地结核病控制工作考核评比给分。 8. 现场督导员的主要责任是通过现场评价发现问题，提出正确的建议解决问题，提高痰涂片镜检质量。 9. 上级实验室对下级进行督导的时候，应当核对调查表和评估实验室实际情况，为此各级调整表应当保存五年以上。 （二）检查步骤：现场评价操作步骤 痰涂片镜检实验室质量保证手册 检验星空特别版 第 19 页 共 40 页 1. 试剂 指 标 检查的问题 试剂名称 可用性 足够用量 现在的染色剂是否都可使用？ 石炭酸复红 是 否 是 否 最近 3 个月是否试剂短缺？ 亚甲蓝 是 否 是 否 使用试剂是否在有效期内？ 5盐酸乙醇是 否 是 否 镜油粘度是否合适？ 镜油 是 否 是 否 二甲苯 是 否 是 否 如有填写“否”的项目，请简要说明原因： 2. 供应 指 标 检查的问题 原料 可用性 质量是否优良 充分供应 玻片 是 否是 否 是 否 储片盒 是 否是 否 是 否 标准痰盒 是 否是 否 是 否 玻片记号笔 是 否是 否 是 否 竹（木）签 是 否是 否 是 否 漏斗 是 否是 否 是 否 滤纸 是 否是 否 是 否 染色架 是 否是 否 是