细胞生物学教案.pdf

细胞（细胞（cellcell）：）：细胞是由膜包围着含有细胞核（或拟核）的原生质所组成，是生物体结构和功能的基本单位，也是生命活动的基本单体。细胞能够通过分裂而增殖，是生物体个体发育和系统发育的基础。非细胞生命体：非细胞生命体：病毒、类病毒、朊病毒细胞生物学：细胞生物学：细胞生物学是以细胞为研究对象,从细胞的整体水平、亚显微水平、分子水平等三个层次，以动态的观点,研究细胞和细胞器的结构和功能、细胞的生活史和各种生命活动规律的学科。细胞生物学是现代生命科学的前沿分支学科之一，主要是从细胞的不同结构层次来研究细胞的生命活动的基本规律。从生命结构层次看，细胞生物学位于分子生物学与发育生物学之间，同它们相互衔接，互相渗透。1.11.1 细胞的发现及细胞学说的创立细胞的发现及细胞学说的创立1.1.11.1.1 细胞的发现细胞的发现第一个发现细胞的是英国学者胡克(Robert Hooke)。1665 年，胡克发表了Micrographia一书,报道用自制的显微镜(30 倍)观察栎树软木塞切片时发现“cella”。(死细胞细胞壁)1674 年，荷兰布商列文虎克(Anton van Leeuwenhoek)自制了高倍显微镜(300 倍左右)观察到池塘水滴中的原生动物、人类和哺乳类动物的精子。(活细胞)1.1.21.1.2 细胞学说的创立细胞学说的创立1838 年，德国植物学家施来登(Mathias Schleiden)发表论文指出植物是由细胞构成的；1839 年，德国动物学家施旺(Theodor Schwan)首次提出细胞学这个名称,并提出了细胞学说(Cell Theory)的前两条原理所有的生物都是由一个或多个细胞组成的；细胞是生命的基本单位。1858 年，德国医生和病理学家魏尔肖(Rudolf Virchow)对细胞学说进行了重要补充并提出细胞学说的第三条原理一切细胞来自于细胞。1.1.31.1.3 细胞生物学发展简史细胞生物学发展简史（1 1）细胞的发现及细胞学说的创立）细胞的发现及细胞学说的创立(1665 18391858 1874)这个时期的主要事件就是上面所述的细胞的发现、细胞学说的提出等。（2 2）细胞学的经典时期）细胞学的经典时期(1875-1900)原生质(protoplasm)理论的提出：1840年Pukinje在动物、1864 von Mohl在植物中发现“肉样质”的物质,并命名为“原生质”;1861 年 Schultze（舒尔策）提出原生质理论：有机体的组织单位是一小团原生质,这种物质在一般有机体中是相似的。并把细胞明确地定义为：“细胞是具有细胞核和细胞膜的活物质”。重要细胞器的发现：1883 年范.贝内登和博费里在动、植物细胞中发现了中心体;1888 年沃尔德耶提出染色体概念;1894 年范.阿尔特曼发现了线粒体;1898 年高尔基(Golgi)发现了高尔基体。（3 3）实验细胞学时期）实验细胞学时期(1900-1953)(1900-1953)experimental cytology是指采用实验的手段研究细胞学的问题，即从形态结构的观察深入到生理功能、生物化学及遗传发育机理的研究。细胞生理学（cytophysiology）的研究：1912年,Carrel研制成Carrel 培养瓶,采用严格的组织培养技术,成功地培养了鸡胚胎成纤维细胞持续了 34 年之久(1912-1946);细胞化学（cytochemistry）的研究细胞遗传学（cytogenetics）的研究分子生物学（Molecular Biology）1953 年 Watson 和 Crick 提出 DNA 双螺旋结模型标志分子生物学的诞生；（4 4）细胞生物学的诞生）细胞生物学的诞生 1965 年，DPDerobetis 将其普通细胞学改为细胞生物学（CellBiology），标志着细胞生物学的诞生；80 年代开始出现了分子细胞生物学（Molecular Cell Biology）。1.21.2细胞的共性细胞的共性1.2.11.2.1 细胞都有选择透性的膜结构细胞都有选择透性的膜结构原生质（原生质（ProtoplasmProtoplasm）：）：被质膜包裹在细胞内的所有的生活物质，包括细胞核和细胞质。细胞质（细胞质（Cell Plasma or cytoplasm)Cell Plasma or cytoplasm)：细胞中细胞核以外和细胞膜以内的原生质部分,包括胞质溶胶和细胞器。原生质体原生质体（ProtoplastProtoplast）：植物细胞和细菌等在酶的作用下脱去细胞壁后剩余部分称为原生质体，原生质体是一个工程学概念。1.2.21.2.2 细胞都具有遗传物质细胞都具有遗传物质 都有 DNA 和 RNA 都有遗传信息流1.2.31.2.3 细胞都具有核糖体细胞都具有核糖体细胞功能的体现者是蛋白质(包括酶)，蛋白质是在核糖体上合成的。1.2.41.2.4 细胞能够进行自我增殖和遗传细胞能够进行自我增殖和遗传动、植物、细菌细胞能够用一分为二的分裂方式进行增殖。1.2.51.2.5 细胞都能进行新陈代谢细胞都能进行新陈代谢1.2.61.2.6 细胞都具有运动性细胞都具有运动性1.2.71.2.7 细胞的其它特性细胞的其它特性细胞的形态与功能相适应。个体中不同组织的细胞形态各异，如 Red Cell、Neuron、Human egg and sperm 等形态各异，它们均与各自的生理功能相适应。细胞的大小及体积相对恒定：典型的原核细胞直径平均在 110m 之间，而真核细胞的直径平均为 330m；某些不同来源的细胞大小变化很大,如人的卵细胞直径只有 0.1mm,而鸵鸟的卵细胞的直径则有 0.5cm；同类型细胞的体积一般是相近的,不依生物个体的大小而增大或缩小。如人、牛、马、鼠、象的肾细胞、肝细胞的大小基本相同；器官的大小主要决定于细胞的数量,与细胞的数量成正比,而与细胞的大小无关，把这种现象为“细胞体积的守恒定律”。细胞维持体积相对恒定的两个因素是:细胞体积与表面积的关系，细胞内关键分子的浓度：一些重要的分子在细胞内的拷贝数很少，当细胞体积增大时，这些分子的浓度就越来越稀释，一些重要的生化反应需要一定的浓度才能进行，所以细胞内分子浓度就成了细胞体积无限增大的一个限制因素。真核细胞如何解决细胞内重要分子的浓度问题真核细胞如何解决细胞内重要分子的浓度问题?（P7P7）细胞不仅对其体积的增大有限制，而且对细胞变小也有限制。为什么？细胞不仅对其体积的增大有限制，而且对细胞变小也有限制。为什么？一个生活细胞要维持正常的独立生活功能，最低限度需要 5001000 种不同类型的酶和蛋白质。细胞的计量单位细胞的计量单位:微米(m)=10-6 m纳米(nm)=10-9 m埃()=10-10 m1.31.3 细胞的分子基础细胞的分子基础1.3.11.3.1细胞中的水细胞中的水以两种形式存在：游离水和结合水；水的作用机制：反应剂和溶剂。1.3.21.3.2无机离子无机离子1.3.31.3.3有机小分子有机小分子细胞内有四类有机小分子：糖类（Sugars）、脂肪酸（Fatty Acids）、核苷酸（Nucleotides）、氨基酸（Amino Acids）。1.3.41.3.4生物大分子生物大分子细胞内有4种类型生物大分子：核酸（Nucleic Acids）、蛋白质（Proteins）、多糖（Polysaccharides，如糖原、淀粉和纤维素）、某些类型的脂类。1.3.51.3.5细胞结构体系组装细胞结构体系组装四级装配四级装配第一级：小分子有机物的形成；第二级：小分子有机物组装成生物大分子；第三级：由生物大分子进一步组装成细胞的高级结构；第四级：由生物大分子组装成具有空间结构和生物功能的细胞器。装配模型：装配模型：模板组装（template assembly）；酶效应组装（enzymatic assembly）；自组装（self assembly）。DNA 转录起始复合物(primosome)mRNA 拼接复合物(splicesome)1.41.4 细胞的类型和结构体系细胞的类型和结构体系1.4.11.4.1 原核细胞（原核细胞（prokaryotic cellprokaryotic cell）没有明显可见的细胞核，同时也没有核膜和核仁只有拟核。包括真细菌(eubacteria)和古细菌(archaebacteria)两大系。最复杂的原核细胞是：蓝细菌；最简单的原核细胞是：支原体。1.细菌细胞质膜的多功能性：中膜体（mesosome）又称间体或质膜体,是细菌细胞质膜向细胞质内陷折皱形成的，每个细胞有一个或数个，其中含有细胞色素和琥珀酸脱氢酶，为细胞提供呼吸酶，具有类似线粒体的作用，故称为拟线粒体。细菌质膜参与 DNA 的复制与分配。2.支原体（mycoplasma），是最简单的原核细胞，直径为 0.10.3 m；具有细胞质膜，但没有细胞壁；环状双螺旋DNA，并均匀地分布在细胞内，没有拟核；惟一的细胞器是核糖体；具感染性，可在培养基上培养。1.4.21.4.2 真核细胞真核细胞(eucaryotic cell)(eucaryotic cell)有明显可见的细胞核、核膜和核仁和核基质。包括：植物、动物、原生生物、真菌等。动物细胞与植物细胞比较动物细胞与植物细胞比较细胞器动物细胞植物细胞细胞壁无有质体（叶绿体、有色体、白色体）无有乙醛酸循环体无有中央液泡无有圆球体无有糊粉粒无有溶酶体有无中心体有无通讯连接方式间隙连接胞间连丝胞质分裂方式收缩环细胞板1.4.31.4.3 真核细胞的结构体系真核细胞的结构体系生物膜体系遗传信息表达体系：该系统包括细胞核和核糖体。细胞骨架体系1.4.41.4.4真核与原核细胞比较真核与原核细胞比较原核细胞与真核细胞比较原核细胞与真核细胞比较(相同点相同点)功能上的共同点结构上的共同点:都是生命的基本结构单位；都有细胞膜；都能进行分裂；都有 DNA 和 RNA；都能遗传。都有核糖体原核细胞与真核细胞比较原核细胞与真核细胞比较(不同点不同点)原核细胞真核细胞代表生物代表生物细菌、蓝藻和支原体植物、动物、原生生物、真菌细胞大小细胞大小较小(1-10m)较大(10100m)细胞膜细胞膜有(多功能性)有核糖体核糖体 70S(50S+30S)80S(60S+40S)细胞器细胞器极少有线粒体、叶绿体、内质网、溶酶体等细胞核细胞核无核膜和核仁有核膜和核仁染色体染色体一个细胞只有一条双链 DNA,一个细胞有两条以上的染色体 DNADNA 不与或很少与组蛋白结合 DNA 与蛋白质联结在一起DNADNA环状，存在于细胞质很长的线状分子，含有很多非编码区，并被核膜所包裹。1.51.5病毒病毒病毒病毒(virus)(virus)主要是由一个核酸分子(DNA 或 RNA)与蛋白质构成的核酸蛋白质复合体，较特殊的情况有类病毒和朊病毒。病毒没有细胞结构，比细胞更小，不能独立生存，只能在活细胞中增殖。类病毒（viroid），仅有一个有感染性的 RNA 构成。朊病毒(prion),，仅有感染性的蛋白质构成。Chapter 2Chapter 2 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法2.12.1 显微成像技术显微成像技术2.1.12.1.1 光学显微镜光学显微镜焦距焦距(focal length)(focal length)：是透镜的中心平面到焦点的距离。角孔径角孔径(angular(angular aperture)aperture)：是光从样品进入显微镜的物镜半角，因此角孔径实际表示有多少光离开样品通过透镜，最好的光学显微镜的角孔径大约是70 度。分辨率分辨率(resolution,(resolution,r)r)：显微镜或人眼在 25 cm 明视距离处，能清楚分辨被检物体细微结构最小间隔的能力。r=0.61/n sin其中：n=聚光镜和物镜之间介质的折射率,空气为 1,油为 1.5;=样品对物镜角孔径的半角=照明光源的波长。0.61 是一个恒定的参数r r 值越小，分辨能力越高。波长越短，分辨能力越高。值越小，分辨能力越高。波长越短，分辨能力越高。分辨极限分辨极限(limit resolution)(limit resolution)：一般地说，一定波长的射线不能用以探查比它本身波长短得多的结构细节，这是一切显微镜的一个基本限度。对可见光（0.40.7 m）来说，能清楚地分辨出相邻两点之间的最小间隔是 0.2 m。放大率放大率(magnification)(magnification)：最终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率。2.1.22.1.2 常用光学显微镜常用光学显微镜1.1.普通光学显微镜普通光学显微镜2.2.荧光显微镜荧光显微镜(fluorescence microscope)(fluorescence microscope)：荧光显微镜以紫外线为光源照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形态及其所在位置。要求：要求：被检物体发荧光（自发荧光、诱发荧光）用途：用途：用于研究细胞内物质的吸收、运输及化学物质的分布和定位等。3.3.相差显微镜相差显微镜(phase contrast microscope)(phase contrast microscope)优点：优点：能够观察无色、透明、活细胞中的结构。特点：特点：能将物体本身的相位差（光程差）转换为振幅（光强度）变化的显微镜。波长(颜色)振幅(亮度)相差(看不见的)实验原理：实验原理：相差显微镜的环状光栏和相板(phase plate)能使活细胞或末经染色的标本中各部分的折射率或厚度的微小差异，产生相位差，然后利用光的衍射和干涉的原理，把相差变成振幅(明暗)之差，使人的肉眼能够辨认出来。相板：相板：装在物镜里，在其上的半透明环上涂有特殊物质（或制成凸、凹面），使通过的光线产生一定的相位差。环状光阑：环状光阑：安装在聚光镜下，使透过聚光镜的光线形成空心光锥，使标本在物镜的焦点面聚光。4.4.暗视野显微镜暗视野显微镜(dark field microscope)(dark field microscope)：利用特殊的聚光器使照明光线不能进入物镜被放大，在黑暗的背景下呈现明亮的像。这种特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高。用途：用途：用以观察未经染色的活体或胶体粒子。特点：特点：主要观察的是物体的轮廓，分辨不清内部的微细结构。5.5.倒置显微镜倒置显微镜(inverted microscope)(inverted microscope)：物镜与照明系统的位置颠倒过来。物镜置于载物台之下，光源位于载物台的上方。集光器与载物台之间的工作距离提高，可以放置培养皿、培养瓶等容器，直接对培养的细胞进行照明和观察。2.1.32.1.3 光学显微镜的样品制备光学显微镜的样品制备1.1.样品的固定样品的固定(fixation)(fixation)目的目的:快速杀死细胞，稳定细胞的化学成份，并且使样品硬化以便在进一步的处理和切片时不会受到破坏。做法做法:将样品浸泡在固定液中。固定使得大分子交联而保持在一定的位置上，不致于在以后的染色等处理过程中移位或丢失而产生人工假象。固定液：固定液：一般用具有缓冲作用的醛类固定液，用甲醛或戊二醛作固定剂，能够与蛋白质的游离氨基形成共价键，从而将邻近的蛋白质分子牢固地交联在一起。2.2.包埋和切片包埋和切片(embedding and sectioning)(embedding and sectioning)包埋：包埋：通常用液态的石蜡或树脂做包埋剂，使之渗入整块组织，使之硬化成固体的包埋块。切片机切割包埋块，制备成薄切片。适用于光学显微镜观察的切片厚度为l10 m。3.3.染色染色(staining)(staining)目的：目的：给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征。苏木精(hematoxylin)：核酸伊红(eosin)：细胞质苏丹染料(Sudan dyes)：脂肪4.4.放射自显影放射自显影用感光胶片测定细胞内某种被放射性标记的物质在细胞固定时所在的位置。2.1.42.1.4 电子显微镜电子显微镜(electron microscope)(electron microscope)1.1.透射电子显微镜透射电子显微镜(transmission electron microscope(transmission electron microscope，TEM)TEM)让电子束穿透样片而成像。2.2.扫描电子显微镜扫描电子显微镜(scanning electron microscopy(scanning electron microscopy，SEM)SEM)用二次电子成像来观察样品的表面结构。2.1.52.1.5 电子显微镜的样品制备电子显微镜的样品制备与光镜相比，组织固定的特殊要求：样品要薄，制成 50100nm 的超薄切片。保持样品的精细结构。样品要具有一定的反差。电子显微镜的样品切片最后被放置在载网上而不是玻片上。染色染色(Stainning)(Stainning)醋酸双氧铀：可与细胞内大多数分子结合，染核酸和蛋白质，但对膜的染色效果较差。柠檬酸铅：核蛋白及糖元结合，也可大大提高细胞膜系统与物质的反差。1.1.负染色负染色(negative stainning)(negative stainning)用重金属作染色剂，对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。由于电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差。这样，在图像中背景是黑暗的，而未包埋的样品颗粒则透明光亮，这种染色称为负染色。2.2.喷镀技术喷镀技术是电子显微镜中一种重要的增强背景和待观察样品反差的方法。显微镜 分辨本领LM光源可见光紫外光（约 200nm)透镜真空成像原理利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化200nm玻璃透镜 不要求真空（400-700nm）100nm石英透镜 不要求真空利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差TEM0.1nm电子束（0.01-0.9）电磁透镜 要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa显微结构（显微结构（microscopic structuremicroscopic structure）：）：光镜下所见到的物体结构。超微结构（超微结构（ultrastructureultrastructure）:又称为亚显微结构。是在光学显微镜下观察不到而只能在电子显微镜下观察的结构。3.3.冰冻蚀刻技术冰冻蚀刻技术是在冰冻断裂技术的基础上发展起来的更复杂的复型技术。如果将冰冻断裂的样品的温度稍微升高，让样品中的冰在真空中升华，而在表面上浮雕出细胞膜的超微结构。当大量的冰升华之后，对浮雕表面进行铂-碳复型，并在腐蚀性溶液中除去生物材料，复型经重蒸水多次清洗后，置于载网上作电镜观察。2.22.2 细胞化学技术细胞化学技术酶细胞化学技术：酶细胞化学技术：通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位。免疫细胞化学技术：免疫细胞化学技术：利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。2.32.3 细胞分选技术细胞分选技术(cell sorting)(cell sorting)细胞分选：细胞分选：用流式细胞仪（flow cytometer，FCM）对细胞或染色体进行分选，并进行定量分析。细胞分选：细胞分选：细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。2.42.4 细胞工程技术细胞工程技术细胞工程：细胞工程：应用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们的设计，改变细胞内遗传物质以获得新型生物或特种细胞的一门综合性科学技术。细胞培养：细胞培养：在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术。正常细胞一般可培养 4050 代。细胞融合细胞融合(cell fusion)(cell fusion)：指自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。细胞融合的诱导药品：灭活的仙台病毒或聚乙二醇单克隆抗体技术单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)(monoclonal antibody technique)：将产生抗体的单个 B淋巴细胞和肿瘤细胞杂交的技术。HAT 培养基包含：次黄嘌呤（H）、胸腺嘧啶（T）、氨基蝶呤（A）显微操作术显微操作术(micromanipulation)(micromanipulation)：用显微操作装置对细胞进行解剖手术和微量注射的技术。动物细胞核移植克隆技术动物细胞核移植克隆技术习题一、名词解释分辨率、显微结构、超微结构二、简要说明电子显微镜和光学显微镜的主要区别三、光学显微镜（荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、倒置显微镜）和电子显微镜（扫描电子显微镜和透射电子显微镜）的原理与应用范围。Chapter 2Chapter 2 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法2.12.1 显微成像技术显微成像技术2.1.12.1.1 光学显微镜光学显微镜焦距焦距(focal length)(focal length)：是透镜的中心平面到焦点的距离。角孔径角孔径(angular(angular aperture)aperture)：是光从样品进入显微镜的物镜半角，因此角孔径实际表示有多少光离开样品通过透镜，最好的光学显微镜的角孔径大约是70 度。分辨率分辨率(resolution,(resolution,r)r)：显微镜或人眼在 25 cm 明视距离处，能清楚分辨被检物体细微结构最小间隔的能力。r=0.61/n sin其中：n=聚光镜和物镜之间介质的折射率,空气为 1,油为 1.5;=样品对物镜角孔径的半角=照明光源的波长。0.61 是一个恒定的参数r r 值越小，分辨能力越高。波长越短，分辨能力越高。值越小，分辨能力越高。波长越短，分辨能力越高。分辨极限分辨极限(limit resolution)(limit resolution)：一般地说，一定波长的射线不能用以探查比它本身波长短得多的结构细节，这是一切显微镜的一个基本限度。对可见光（0.40.7 m）来说，能清楚地分辨出相邻两点之间的最小间隔是 0.2 m。放大率放大率(magnification)(magnification)：最终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率。2.1.22.1.2 常用光学显微镜常用光学显微镜1.1.普通光学显微镜普通光学显微镜2.2.荧光显微镜荧光显微镜(fluorescence microscope)(fluorescence microscope)：荧光显微镜以紫外线为光源照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形态及其所在位置。要求：要求：被检物体发荧光（自发荧光、诱发荧光）用途：用途：用于研究细胞内物质的吸收、运输及化学物质的分布和定位等。3.3.相差显微镜相差显微镜(phase contrast microscope)(phase contrast microscope)优点：优点：能够观察无色、透明、活细胞中的结构。特点：特点：能将物体本身的相位差（光程差）转换为振幅（光强度）变化的显微镜。波长(颜色)振幅(亮度)相差(看不见的)实验原理：实验原理：相差显微镜的环状光栏和相板(phase plate)能使活细胞或末经染色的标本中各部分的折射率或厚度的微小差异，产生相位差，然后利用光的衍射和干涉的原理，把相差变成振幅(明暗)之差，使人的肉眼能够辨认出来。相板：相板：装在物镜里，在其上的半透明环上涂有特殊物质（或制成凸、凹面），使通过的光线产生一定的相位差。环状光阑：环状光阑：安装在聚光镜下，使透过聚光镜的光线形成空心光锥，使标本在物镜的焦点面聚光。4.4.暗视野显微镜暗视野显微镜(dark field microscope)(dark field microscope)：利用特殊的聚光器使照明光线不能进入物镜被放大，在黑暗的背景下呈现明亮的像。这种特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高。用途：用途：用以观察未经染色的活体或胶体粒子。特点：特点：主要观察的是物体的轮廓，分辨不清内部的微细结构。5.5.倒置显微镜倒置显微镜(inverted microscope)(inverted microscope)：物镜与照明系统的位置颠倒过来。物镜置于载物台之下，光源位于载物台的上方。集光器与载物台之间的工作距离提高，可以放置培养皿、培养瓶等容器，直接对培养的细胞进行照明和观察。2.1.32.1.3 光学显微镜的样品制备光学显微镜的样品制备1.1.样品的固定样品的固定(fixation)(fixation)目的目的:快速杀死细胞，稳定细胞的化学成份，并且使样品硬化以便在进一步的处理和切片时不会受到破坏。做法做法:将样品浸泡在固定液中。固定使得大分子交联而保持在一定的位置上，不致于在以后的染色等处理过程中移位或丢失而产生人工假象。固定液：固定液：一般用具有缓冲作用的醛类固定液，用甲醛或戊二醛作固定剂，能够与蛋白质的游离氨基形成共价键，从而将邻近的蛋白质分子牢固地交联在一起。2.2.包埋和切片包埋和切片(embedding and sectioning)(embedding and sectioning)包埋：包埋：通常用液态的石蜡或树脂做包埋剂，使之渗入整块组织，使之硬化成固体的包埋块。切片机切割包埋块，制备成薄切片。适用于光学显微镜观察的切片厚度为l10 m。3.3.染色染色(staining)(staining)目的：目的：给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征。苏木精(hematoxylin)：核酸伊红(eosin)：细胞质苏丹染料(Sudan dyes)：脂肪4.4.放射自显影放射自显影用感光胶片测定细胞内某种被放射性标记的物质在细胞固定时所在的位置。2.1.42.1.4 电子显微镜电子显微镜(electron microscope)(electron microscope)1.1.透射电子显微镜透射电子显微镜(transmission electron microscope(transmission electron microscope，TEM)TEM)让电子束穿透样片而成像。2.2.扫描电子显微镜扫描电子显微镜(scanning electron microscopy(scanning electron microscopy，SEM)SEM)用二次电子成像来观察样品的表面结构。2.1.52.1.5 电子显微镜的样品制备电子显微镜的样品制备与光镜相比，组织固定的特殊要求：样品要薄，制成 50100nm 的超薄切片。保持样品的精细结构。样品要具有一定的反差。电子显微镜的样品切片最后被放置在载网上而不是玻片上。染色染色(Stainning)(Stainning)醋酸双氧铀：可与细胞内大多数分子结合，染核酸和蛋白质，但对膜的染色效果较差。柠檬酸铅：核蛋白及糖元结合，也可大大提高细胞膜系统与物质的反差。1.1.负染色负染色(negative stainning)(negative stainning)用重金属作染色剂，对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。由于电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差。这样，在图像中背景是黑暗的，而未包埋的样品颗粒则透明光亮，这种染色称为负染色。2.2.喷镀技术喷镀技术是电子显微镜中一种重要的增强背景和待观察样品反差的方法。显微镜 分辨本领光源透镜真空成像原理LM200nm可见光紫外光（约 200nm)玻璃透镜 不要求真空利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化（400-700nm）100nm石英透镜 不要求真空利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差TEM0.1nm电子束（0.01-0.9）电磁透镜 要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa显微结构（显微结构（microscopic structuremicroscopic structure）：）：光镜下所见到的物体结构。超微结构（超微结构（ultrastructureultrastructure）:又称为亚显微结构。是在光学显微镜下观察不到而只能在电子显微镜下观察的结构。3.3.冰冻蚀刻技术冰冻蚀刻技术是在冰冻断裂技术的基础上发展起来的更复杂的复型技术。如果将冰冻断裂的样品的温度稍微升高，让样品中的冰在真空中升华，而在表面上浮雕出细胞膜的超微结构。当大量的冰升华之后，对浮雕表面进行铂-碳复型，并在腐蚀性溶液中除去生物材料，复型经重蒸水多次清洗后，置于载网上作电镜观察。2.22.2 细胞化学技术细胞化学技术酶细胞化学技术：酶细胞化学技术：通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位。免疫细胞化学技术：免疫细胞化学技术：利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。2.32.3 细胞分选技术细胞分选技术(cell sorting)(cell sorting)细胞分选：细胞分选：用流式细胞仪（flow cytometer，FCM）对细胞或染色体进行分选，并进行定量分析。细胞分选：细胞分选：细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。2.42.4 细胞工程技术细胞工程技术细胞工程：细胞工程：应用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们的设计，改变细胞内遗传物质以获得新型生物或特种细胞的一门综合性科学技术。细胞培养：细胞培养：在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术。正常细胞一般可培养 4050 代。细胞融合细胞融合(cell fusion)(cell fusion)：指自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。细胞融合的诱导药品：灭活的仙台病毒或聚乙二醇单克隆抗体技术单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)(monoclonal antibody technique)：将产生抗体的单个 B淋巴细胞和肿瘤细胞杂交的技术。HAT 培养基包含：次黄嘌呤（H）、胸腺嘧啶（T）、氨基蝶呤（A）显微操作术显微操作术(micromanipulation)(micromanipulation)：用显微操作装置对细胞进行解剖手术和微量注射的技术。动物细胞核移植克隆技术动物细胞核移植克隆技术习题一、名词解释分辨率、显微结构、超微结构二、简要说明电子显微镜和光学显微镜的主要区别三、光学显微镜（荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、倒置显微镜）和电子显微镜（扫描电子显微镜和透射电子显微镜）的原理与应用范围。