DNA琼脂糖凝胶电泳.doc

DNA琼脂糖凝胶电泳一,实验原理 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术.把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中,并置于静电场上.由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基,因此在电场中向正极移动.在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,因而可依据DNA分子的大小来使其分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,而构型不同的DNA分子.在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测.相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准.在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB),其分子可插入DNA的碱基之间,形成一种络合物,在254365nm波长紫外光照射下,呈桔红色荧光,因此也可对分离的DNA进行检测. 一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb50kb范围内的DNA片段.本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法.琼脂糖凝胶浓度（%） 线状DNA分子分离范围（kb）0.3 5-600.6 1-200.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-2琼脂糖凝胶电泳是用于分离纯化和鉴定核酸的方法，根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖。低熔点琼脂糖的熔点为62-65,溶解后在37下维持液体状态约数小时,主要用于DNA片断的回收、质粒与外源性DNA的快速连接等。DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速度与琼脂糖浓度、DNA分子量及其构象、电泳缓冲液、电场强度等因素有关，一般说来，DNA片断越大或者琼脂糖浓度越大，其迁移速率越大；而电场强度越高，其迁移速率越大。不同浓度琼脂糖凝胶DNA分离范围见上图表。二,仪器及试剂1.仪器及耗材:水平电泳槽,电泳仪,凝胶成像分析系统,微波炉,微量移液器,透明胶带,点样或parafilm,100 ml或250 ml锥形瓶,量筒,吸头等.2.试剂及配制:50×TAE缓冲液的配制:2 mol/L Tris-乙酸,0.05 mol/L EDTA(pH 8.0)配制1000 mlTris 242 g冰乙酸 57.1 ml0.5 mol/L EDTA 100 ml加入600 ml去离子水后搅拌溶解,将溶液定容至1 L后.高温高压灭菌,室温保存.1×TAE缓冲液的配制:称量20 ml的50×TAE缓冲液,再加入980 ml的去离子水.溴化乙啶贮存液:10 mg/ml 溴化乙啶配制:100 ml称取1 g溴化乙啶,置于100 ml烧杯中,加入80 ml去离子水后搅拌溶解.将溶液定容至100 ml后,转移到棕色瓶中.室温保存.6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,30%甘油.配制:10 ml溴酚蓝 25 mg二甲苯青FF 25 mg甘油 3 ml用6×TAE缓冲液定溶至10 ml,分装成1 ml/管.-20保存.其它试剂:DNA样品,DNA Ladder ,琼脂糖三,操作步骤1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液.2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.(5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min.(6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存.四,常见问题及注意事项1.配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶.2.琼脂糖凝胶易于破碎,操作时要轻缓.3.电泳时应注意电源线路,预防触电.4.溴化乙淀具有致癌作用,配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套.并在专门的实验室内使用.5.紫外线对人体有损伤作用,开灯时间不宜太长,注意防护.6.DNA带形状模糊:DNA加样过多;电压太高;凝胶中有气泡.7.质粒DNA的存在形式有3种,共价闭环DNA(cccDNA),常以超螺旋形式存在;开环DNA(ocDNA),此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂,因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子;线状DNA,因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成.因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带,它们的泳动速度为:cccDNA > 线状DNA > ocDNA.添加来自TIANGEN的资料:1,琼脂糖:不同厂家不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同,影响DNA的迁移及其荧光背景的强度,应有选择的使用.2,凝胶的制备:凝胶中所加的缓冲液应该与电泳槽中的相一致,溶化的凝胶应该及时倒入板中,避免倒入之前凝固结块,倒入板中的凝胶应该避免出现气泡,以免影响电泳结果.3,电泳缓冲液:为保持电泳所需的离子强度和PH,应经常更新电泳缓冲液.4,样品加入量:一般情况下,0.5CM宽的梳子可加0.5微克的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片断的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清楚;反之,则应该适当减少加样量,但是上样量过多会造成加样孔超载,从而导致拖尾或扩散,对于较大的DNA此现象更明显.5,DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率,平行对照样品中应该使用同样的缓冲条件以消除这种影响.6,DNA迁移率取决于琼脂糖的浓度,迁移分子的形状及其大小.采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子,制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度.小片断DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,以提高分辨率.