细胞重组与细胞融合.ppt

第七章第七章 细胞重组与细胞融合细胞重组与细胞融合一、细胞重组一、细胞重组二、二、细胞融合细胞融合一、细胞重组一、细胞重组（一）概述（一）概述 1 概念概念 通过一定的实验技术，从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其装配成具有生物活性的细胞或细胞器，又称细胞拆合。2 特点特点 细胞重组最初只在细胞核、质之间的移植，现在发展到可以人为的对细胞任何的不同组分进行组合，大大扩展了在细胞工程研究中的应用。3 意义意义 1）研究核质关系 2）研究细胞器的功能及相互作用关系 3）研究细胞器的组装，甚至细胞的自我装配机理，以揭示细胞起源与进化的机制。4）结合基因转移技术，可人为地使细胞表达新的性状和产生新的产物，实现掌握细胞、利用细胞、改造并进而创造出具有特定性状和功能的工程细胞。（二）细胞重组技术（二）细胞重组技术 细胞重组的方式及有关概念细胞重组的方式及有关概念 1）胞质体与完整细胞的融合形成胞质杂种；2）微细胞与完整细胞的融合形成微细胞异核体；3）胞质体与核体（小细胞）融合形成重组细胞（核质杂种）胞质体（cytoplast,cytosome)：除去细胞核后由细胞膜包裹的结构。小细胞（minicell）：又称核体，具有细胞核、带有薄层细胞质。微细胞（microcell）：含有一个微核（仅有一条或几条染色体）并带有薄层细胞质。1 显微操作技术显微操作技术 在显微镜下或借助于显微操作仪，用细微玻璃针或微吸管、微电极等对细胞进行人为操作。2 细胞分离技术细胞分离技术 1）梯度沉降分离法 2）等密度沉降分离法 3）流式细胞仪分离法3 细胞破碎方法细胞破碎方法 1）超声波破碎法 2）反复冻溶法 3）化学裂解法 4）高速组织倒碎法 4 细胞器的分离细胞器的分离5 胞质体、核体和微细胞的制备胞质体、核体和微细胞的制备 最常使用方法是：物理法结合显微操作技术 化学法结合离心技术制备 1）胞质体 首先用细胞松弛素B处理细胞诱发其排核，然后震荡离心分离得到胞质体。2）核体 在得到胞质体的同时，离心收集排除的有完整细胞核，带有少量细胞质并围有完整细胞膜的结构便是核体。3）微细胞 首先用秋水仙素处理，染色体停滞在有丝分裂中期，体外培养过程中，在单个染色体或染色体周缘会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。6 细胞器拆合重组举例细胞器拆合重组举例 细胞器的移植主要是指叶绿体和线粒体的移植。如卡尔森用白化型原生质体摄取正常的叶绿体，进而发育成正常的绿色植物；或有人用抗药型草履虫的线粒体植入敏感的草履虫细胞，使后者获得抗药性等。二、二、细胞融合细胞融合(cell fusion)（一）、细胞融合的概念细胞融合的概念 用人工方法把同种或不同种的两个或两个以上的细胞，通过介导物作用，融合成一个细胞的技术。亦称体细胞杂交（somatic hybridization）（二）、（二）、细胞融合的意义（应用）细胞融合的意义（应用）1 进行基因定位，绘制人类基因图进行基因定位，绘制人类基因图基因定位的方法基因定位的方法家系分析法细胞融合法基因剂量效应法重组DNA法分子杂交法限制性片段长度多态性技术脉冲电泳法（PEGE）基因图基因图：指将人类染色体上所有基因按其具体位置、次序和间隔距离详细地排列而成的图，又叫染色体连锁图2 诱导诱导PC染色体染色体3 体细胞杂种的致瘤性分析体细胞杂种的致瘤性分析4 遗传缺陷的基因互补遗传缺陷的基因互补5 分化功能表达调控的研究分化功能表达调控的研究6 淋巴细胞杂交瘤技术与单克隆抗体淋巴细胞杂交瘤技术与单克隆抗体由单个杂交瘤细胞增殖产生的克隆细胞群分泌的高度纯一的抗体称为单克隆抗体7 植物细胞的原生质体融合培育杂种植株植物细胞的原生质体融合培育杂种植株8 核质相互作用关系核质相互作用关系9 基因治疗基因治疗10 疾病诊断疾病诊断（三）、细胞融合的机理细胞融合的机理 膜融合是两个不同的膜相互接触和融合，导致两膜脂和膜蛋白的相互混合及两侧内含物的混合。细胞融合的基本步骤包括：1 细胞密切靠近 2 细胞桥形成 3 细胞质渗透 4 细胞核融合 融合机制种种融合机制种种1）“脂无序脂无序”模型模型 Lucy，1970-19752）Ca2+诱导的侧向诱导的侧向“相分离相分离”模型模型 Papahadjopoulos 19783）六角形）六角形HII构象与膜融合构象与膜融合 Cullis and Hope19784）Ca2+诱导局部脱水与膜融合诱导局部脱水与膜融合 Wilschut and Hoekstra 19845）渗透模型与膜融合）渗透模型与膜融合 Lucy 19866）质子泵驱动膜融合）质子泵驱动膜融合 刘树森1986 膜融合过程大体概括为两大阶段：首先是两膜脂相互聚合和接触，其次是接触部位的局部脱水，形成不稳定中间结构，使膜脂发生混合而最终导致膜的融合（四）、细胞融合的材料细胞融合的材料1 植物或微生物原生质体的制备2 动物单个细胞的获得 酶解消化法（胰蛋白酶、胶原酶）（五）、（五）、细胞融合的方法细胞融合的方法1、生物法、生物法病毒诱导细胞融合病毒诱导细胞融合 仙台病毒（仙台病毒（Sendal virus）又称日本血凝性病毒又称日本血凝性病毒（HVJ），），是一种是一种RNA病毒，病毒，1962年冈田善雄发年冈田善雄发现，能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞。现，能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞。引起细胞融合的有效部位在于它的细胞膜成分，引起细胞融合的有效部位在于它的细胞膜成分，特别是磷脂成分，而与核酸活性无关。特别是磷脂成分，而与核酸活性无关。2、化学法、化学法PEG结合高结合高Ca2+、pH诱导法诱导法1）高级脂肪酸衍生物2）脂质体3）钙离子4）水溶性高分子化合物聚乙二醇（PEG）最为常用 5）水溶性蛋白质和多肽（如牛血清蛋白）20世纪70年代，华裔加籍科学家高国楠发现PEG能促进植物原生质体融合，开辟了植物细胞融合的研究。目前化学法主要包括：NaNO3诱导、高Ca2+、和pH诱导、PEG诱导、PEG结合高Ca2+和pH诱导等，后者最为常用。A、基本原理基本原理 PEG(polyethylene glycol)是一种多聚化合物，分子式为H(OHCH2-CH2)nOH，平均分子量在20020000之间。诱导机制可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间在钙离子的作用下形成静电键，促使原生质体间的黏着而结合，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。B、基本过程及注意事项基本过程及注意事项 （1）亲本原生质体事先做好识别标记（色素、缺陷型、抗性标记等）（2）原生质体密度在105/ml左右，比例1：1 （3）PEG分子量通常为40006000，浓度50%（4）加入PEG后迅速混匀，置24培育1020min，然后缓缓加入高pH、高钙离子溶液，15min后用洗涤液洗涤，离心收集。3、物理法、物理法电场诱导细胞融合电场诱导细胞融合 电融合是20世纪80年代发展起来的。优点是融合率高、重复性强、伤害小、方法简便易行、可在显微镜下观察融合的全过程。原生质体在短时间内强电场（高压脉冲电场，场强为kV/cm量级）作用下，极化产生偶极子，紧密排开成串珠状，在适当时间和强度（如50mA、1.2kV/cm)的直流电脉冲作用下，细胞膜被击穿，进一步形成融合体。4、物理法、物理法激光诱导细胞融合激光诱导细胞融合 更具高度选择性、有效性（六）、融合细胞的选择（六）、融合细胞的选择1 融合体的类型融合体的类型 在整个融合液中，除了未融合的单亲细胞外，主要包括三种类型的融合细胞。1）同核体同源原生质体的融合 2）异核体非同源原生质体的融合 3）多核体含有双亲不同比例核物质的融合体 2融合体的筛选方法融合体的筛选方法3 1 1）遗传互补筛选法）遗传互补筛选法4 4 2 2）抗性互补筛选法）抗性互补筛选法5 5 3 3）生长特性筛选法）生长特性筛选法6 6 4 4）物理特性筛选法）物理特性筛选法7 7 5 5）其他方法）其他方法（七）、细胞融合技术的应用举例（七）、细胞融合技术的应用举例 制备细胞悬液制备细胞悬液 双亲细胞的选择诱导细胞融合诱导细胞融合杂种细胞筛选杂种细胞筛选1）由抗药性细胞组成的杂种细胞筛选）由抗药性细胞组成的杂种细胞筛选2）由营养缺陷变异型细胞组成的杂种的筛选）由营养缺陷变异型细胞组成的杂种的筛选3）由温度敏感突变型细胞组成的杂种的筛选）由温度敏感突变型细胞组成的杂种的筛选杂种细胞的培养杂种细胞的培养1 1、动物细胞融合技术的基本步骤、动物细胞融合技术的基本步骤 动物细胞融合举例动物细胞融合举例单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备1 单克隆抗体的制作原理单克隆抗体的制作原理2 单克隆抗体的制作过程单克隆抗体的制作过程1）动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备2）骨髓瘤细胞的获得与培养3）细胞融合4）抗体的检测及杂交瘤的选择5）单抗的大量生产 细胞合成细胞合成DNA有两条途径有两条途径主要途径（生物合成）：主要途径（生物合成）：糖、氨基酸核苷酸DNA 此途径可因加氨基碟呤（A，一种叶酸的抵抗剂）被阻断。DNA合成过程中所需的脱氧胸苷酸（dTMP）是由脱氧尿苷酸（dUMP）经甲基化形成。甲基供体是四氢叶酸，四氢叶酸是由二氢叶酸还原酶还原二氢叶酸而来。氨基碟呤在分子结构上是二氢叶酸的类似物，可与二氢叶酸竞争二氢叶酸还原酶发生不可逆结合，从而阻断四氢叶酸的形成，不能提供甲基形成dUMP，最后阻断DNA的合成。3 杂交瘤筛选原理杂交瘤筛选原理 当上面主要途径被阻断时可由此途径代替补充，即可在次黄嘌呤核糖核酸转移酶（HGPRT+）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK+）作用下，利用H（次黄嘌呤）合成嘌呤核苷酸，利用T（胸腺嘧啶）来合成胸腺嘧啶核苷酸，进而合成DNA。救急（应急）途径救急（应急）途径HAT筛选法筛选法 一个亲本细胞株为次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT）另一个亲本细胞株为胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK）在含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T）的HAT选择培养液中，上述亲本细胞都无法生存，只有融合以后的杂种细胞才能生长，因此可有效地选择出杂种细胞。杂交瘤筛选过程杂交瘤筛选过程亲本亲本1（突变型细胞株）（突变型细胞株）亲本亲本2骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞（或胸腺瘤细胞）（或胸腺瘤细胞）（HGPRT和和TK）（HGPRT+和和TK+）加加A后正常和应急两条途径后正常和应急两条途径均被阻断不能合成均被阻断不能合成DNA 加加A后主要（正常）途径被阻断，后主要（正常）途径被阻断，可走应急途径合成可走应急途径合成DNA，但该细，但该细胞在一般培养条件下不能较长时间胞在一般培养条件下不能较长时间存活，只有同瘤细胞融合后才获取存活，只有同瘤细胞融合后才获取无限增殖能力无限增殖能力故只有杂交细胞才能在故只有杂交细胞才能在HAT培养基上增殖培养基上增殖（骨髓瘤细胞从免疫脾细胞获取（骨髓瘤细胞从免疫脾细胞获取HGPRT+和和TK+，脾细胞则从骨髓瘤脾细胞则从骨髓瘤细胞获取无限增殖能力）细胞获取无限增殖能力）免疫脾细胞免疫脾细胞（三）植物原生质体的培养与融合三）植物原生质体的培养与融合总过程包括：原生质体的制备 原生质体的培养 原生质体的融合 杂种细胞的筛选 杂种细胞的分化1 原生质体培养的意义原生质体培养的意义 1）融合产生体细胞杂种 2）分离或引入各种细胞器 3）导入外源基因 4）诱发突变体 5）研究细胞信息传递、能量代谢、物质运输等功能 6）研究细胞壁的合成机理 7）研究膜的功能和细胞膜的相互作用 8）研究核质关系 9）研究疾病与抗性生理2 原生质体的制备原生质体的制备 3 原生质体的培养原生质体的培养 1）培养方法）培养方法 液体培养法液体培养法 固体平板培养法固体平板培养法 双层培养法双层培养法4 原生质原生质体的融合体的融合 植物细胞杂交是指将两个原生质体融合成一个细胞的过程，又称体细胞杂交。Cocking（1971）建议程序的代表图示 起源细胞（降解细胞壁）亲本原生质体（诱导融合）集聚粘连胞质融合（异核体培养）核融合、壁再生（杂种细胞选择）细胞分裂（杂种愈伤组织)诱导分化（器官、胚状体形成）杂种植株5 再生植株的种类再生植株的种类 由于核融合的情况不同，形成不同的杂种植株。1）亲和的细胞杂种 具有双亲全套染色体，异源双二倍体。2）部分亲和的细胞杂种 一个亲本的染色体有少量重建或重组于另一亲本的染色体组中。3）胞质杂种 一亲本的染色体被全部排斥，但胞质是双亲的4）异核质杂种 具有一个亲本细胞核和另一个亲本细胞质的类型。4）利用生长特性选择6 融合细胞融合细胞和和杂种筛选杂种筛选1)利用遗传互补选择 a 叶绿体缺失互补选择b 营养缺陷型互补选择c 抗性互补选择2)敏感差异选择3)利用物理特性选择1978年，西德科学家获得蕃茄马铃薯的杂种植株；1982年，美国培育出“土豆西红柿”；1986年，日本培育出稻（C3）和稗（C4）之间的新品种，同时“生物白蓝”（38）白菜（20）+甘蓝（18）成功；1988年，联邦德国培育出地下结马铃薯，地上结西红柿的“马铃柿”。近20几年来，利用细胞杂交技术培育出众多的杂种植株。动、植物细胞杂种“牛肉蕃茄”7 杂种细胞的再鉴定杂种细胞的再鉴定1）杂种植株和亲本植株的形态学特征比较2）杂种和亲本的核型分析3）杂种和亲本的同工酶谱分析4）分子生物学方法 已得到的细胞杂种已得到的细胞杂种8 细胞杂交的几个重要进展细胞杂交的几个重要进展八、细胞融合技术的进展与展望八、细胞融合技术的进展与展望 1 不对称融合将亲本之一遗传物质部分破坏后再同另一完整原生质体融合的方式。结果形成各种非整倍体。2 胞质杂种是一亲本去核后的胞质体与另一亲本完整细胞的融合。复习思考题1 什么是细胞融合？诱导细胞融合有几种方法？2 试述细胞融合的基本原理。3 细胞融合技术有哪些应用？