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实验实验4 细胞融合细胞融合 杂交的目的杂交的目的-制备单克隆抗体制备单克隆抗体 动物免疫动物免疫一、可溶性抗原一、可溶性抗原1wk 1wk 抗原抗原50g/50g/只，溶于只，溶于300l 300l 生理盐水中，生理盐水中，加入等量福氏完全佐剂（加入等量福氏完全佐剂（CFACFA）充分乳化，）充分乳化，分颈、部皮下多点及腹腔注射；分颈、部皮下多点及腹腔注射；3wk 3wk 抗原的剂量及注射的部位同上，仅将全佐抗原的剂量及注射的部位同上，仅将全佐 改为半佐（改为半佐（IFAIFA）；）；5wk 5wk 抗原抗原50g/50g/只，溶于只，溶于300l 300l 生理盐水中，生理盐水中，腹腔注射；腹腔注射；加强加强 融合前融合前3535天天 抗原抗原2030g/2030g/只，溶于只，溶于 50l 50l 生理盐水中，小鼠尾静脉注射以加生理盐水中，小鼠尾静脉注射以加 强免疫。强免疫。二、细胞抗原二、细胞抗原1wk 1wk 细胞数量细胞数量8108106 6个个/只，洗涤三遍，用只，洗涤三遍，用0.30.4ml0.30.4ml的生理的生理 盐水重新悬浮，腹腔注射；盐水重新悬浮，腹腔注射；3wk 3wk 细胞数量细胞数量6106106 6个个 /只，细胞的预处理及注射的部位同上；只，细胞的预处理及注射的部位同上；5wk 5wk 细胞数量细胞数量5105106 6个个 /只，细胞的预处理及注射的部位同上；只，细胞的预处理及注射的部位同上；加强加强 融合前的融合前的4545天天 细胞数量细胞数量3103106 6 个个/只，加强免疫。只，加强免疫。在以肿瘤细胞作免疫原时，为避免免疫过程中小鼠因生长肿在以肿瘤细胞作免疫原时，为避免免疫过程中小鼠因生长肿 瘤而死亡。故用丝裂霉素处理免疫原细胞，抑制其生长繁殖瘤而死亡。故用丝裂霉素处理免疫原细胞，抑制其生长繁殖 以防形成肿瘤。最后的加强免疫，肿瘤细胞可不经丝裂霉素以防形成肿瘤。最后的加强免疫，肿瘤细胞可不经丝裂霉素 处理，因处理，因4545天后即进行融合天后即进行融合。免疫脾细胞的制备免疫脾细胞的制备处死小鼠，固定于解剖架上打开腹腔，取出脾脏。处死小鼠，固定于解剖架上打开腹腔，取出脾脏。置置于于120120目的钢丝网中目的钢丝网中，将网移入盛有，将网移入盛有20ml20ml生理盐水生理盐水的平皿中，用注射针芯轻轻压磨，使其成为单个细胞的平皿中，用注射针芯轻轻压磨，使其成为单个细胞悬液，吸取悬液，吸取1ml1ml细胞悬液（约细胞悬液（约5105106 6细胞）细胞）,与骨髓与骨髓瘤细胞瘤细胞SP2/0（5105105 5细胞细胞）混合，）混合，离心后弃上清。离心后弃上清。1 1、骨髓瘤细胞、骨髓瘤细胞:免疫脾细胞为免疫脾细胞为1:10 2 2、一个脾脏可获约、一个脾脏可获约108个细胞个细胞 1、取 PEG溶液溶液1.0ml 缓慢加入混合细胞中缓慢加入混合细胞中,边加边搅拌；边加边搅拌；2、静止、静止1分钟；分钟；3、加、加HAT培养基培养基4ml；细胞的融合：细胞的融合：4 4、取融合细胞悬液、取融合细胞悬液1ml,1ml,滴加在滴加在9696孔培养板中，每孔孔培养板中，每孔1 1滴（约滴（约50l50l）；）；5 5、显微镜下观察融合细胞的状态。、显微镜下观察融合细胞的状态。实验目的：实验目的：1、了解细胞杂交及单抗制备的基本原理；、了解细胞杂交及单抗制备的基本原理；2、掌握细胞融合的基本操作。、掌握细胞融合的基本操作。实验结束后，将实验小鼠放入垃圾袋，使用过的实验结束后，将实验小鼠放入垃圾袋，使用过的 剪刀、镊子、试管及培养板等冲洗干净，放回原剪刀、镊子、试管及培养板等冲洗干净，放回原 处，谢谢合作！处，谢谢合作！