化妆品微生物检验方法.doc

|一、 总 则1.范围本规范规定了化妆品微生物检验的基本要求。本规范适用于化妆品样品的采集、保存及供检样品制备。2.仪器和设备2.1 天平。2.2 高压灭菌器。2.3 振荡器。2.4 三角瓶，250mL。2.5 玻璃珠。2.6 琉璃棒。2.7 刻度吸管，1mL、10mL。2.8 研钵或均质器。2.9 恒温水浴箱。3.培养基和试剂3.1 生理盐水成分：氯化钠 8.5g蒸馏水加至 1000mL溶解后，分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶 90 mL，103.43kPa (121 15 lb)20min 高压灭菌。3.2 SCDLP 液体培养基成分：酪蛋白胨 17g大豆蛋白胨 3g氯化钠 5g磷酸氢二钾 2.5g葡萄糖 1g吐温 80 7g蒸馏水 1000mL制法：先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其它成分混合，加热溶解，调 pH 为 7.27.3 分装，103.43 kPa (121 15 lb)20min 高压灭菌。注意振荡，使沉淀于底层的吐温 80 充分混合，冷却至 25左右使用。注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。3.3 灭菌液体石蜡。3.4 灭菌吐温 80。4.样品的采集及注意事项4.1 所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取 10g 或 10mL。包装量小于 20g 的样品，采样量可适当增加样品包装数量。4.2 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。4.3 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。4.4 若只有一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做细菌检验，再将剩|余样品做其它分析。4.5 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。4.6 如检出粪大肠菌群或其它致病菌，自报告发出之日起该菌种及被检样品应保存一个月。5.供检样品的制备5.1 液体样品5.1.1 水溶性的液体样品，可量取 10mL 加到 90mL 灭菌生理盐水中，如样品少于 10mL，仍按 10 倍稀释法进行。如为 5mL 则加到 45mL 灭菌生理盐水中，混匀后制成 1：10 检液。5.1.2 油性液体样品，取样品 10mL,先加 5mL 灭菌液体石蜡混匀，再加 10mL 灭菌的吐温 80,在 4044水浴中充分混合，制成 1：10 检液。5.3 固体样品称取 10g，加到 90mL 灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液作为 1：10 的检液。如有均质器，上述水溶性膏、霜、粉剂等，可称 10g 样品加入 90mL 灭菌生理盐水，均质 1min2min；疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称 10g 样品，加入 10mL 灭菌液体石蜡，10mL 吐温 80,70mL 灭菌生理盐水，均质 3min5min。二、菌落总数1.范围本规范规定了化妆品中菌落总数的检验方法。本规范适用于化妆品菌落总数的测定。2.定义本规范采用下列定义菌落总数（Aerobic bacterial count）是指化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度、培养时间、pH 值、需氧性质等） ，1g(1mL)检样中所含菌落的总数。所得结果只包括一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性菌落总数。测定菌落总数便于判明样品被细菌污染的程度，是对样品进行卫生总评价的综合依据。3.仪器和设备3.1 三角瓶，250mL。3.2 量筒，200mL。3.3 pH 计或精密 pH 试纸。3.4 高压灭菌器。3.5 试管：15×150mm。3.6 灭菌平皿：直径 9cm。3.7 灭菌刻度吸管，10mL、1mL。3.8 酒精灯。3.9 恒温培养箱：36±1。3.10 放大镜。4.培养基和试剂4.1 生理盐水：见总则中 3.1。|4.2 卵磷脂、吐温 80-营养琼脂培养基4.2.1 成分：蛋白胨 20g牛肉膏 3g氯化钠 5g琼脂 15g卵磷脂 1g吐温 80 7g蒸馏水 1000mL4.2.2 制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温 80,将其他成分（除琼脂外）加到其余的蒸馏水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐温 80,混匀，调 pH 值为 7.17.4,加入琼脂，103.43kPa (121 15 lb)20min高压灭菌，储存于冷暗处备用。4.3 0.5%氯化三苯四氮唑（ 2,3,5-triphenyl terazolium chloride,TTC）成分：TTC 0.5g蒸馏水 1000mL溶解后过滤，103.43kPa (121 15 lb)20min 高压灭菌，装于棕色试剂瓶，置 4冰箱备用。5.操作步骤5.1 用灭菌吸管吸取 1：10 稀释的检液 2mL,分别注入到两个灭菌平皿内，每皿 1mL。另取 1mL 注入到 9mL 灭菌生理盐水试管中（注意勿使吸管接触液面） ，更换一支吸管，并充分混匀，制成 1：100 检液。吸取 2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿 1mL。如样品含菌量高，还可再稀释成 1：1000,1：10000，等，每种稀释度应更换 1 支吸管。5.2 将融化并冷至 4550的卵磷脂吐温 80 营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约 15 mL,随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置 36±1培养箱内培养 48h±2h。另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约 15mL 卵磷脂吐温 80 营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置 36±1培养箱内培养48h±2h，为空白对照。5.3 为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每 100mL 卵磷脂吐温 80 营养琼脂中加入 1mL 0.5%的 TTC 溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。6菌落计数方法先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大 5 倍10 倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出同一个稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以 2,以代表全皿菌落数。7.菌落计数及报告方法7.1 首先选取平均菌落数在 30 个300 个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数（见表 1 中例 1） 。7.2 若有两个稀释度，其平均菌落数均在 30 个300 个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于 2,应报告其平均数，若大于 2 则报告其中稀释度较低的平皿的菌落数（见表 1 中例 2 及例 3） 。7.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于 300 个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表 1中例 4） 。7.4 若所有稀释度的平均菌落数均小于 30 个，刚应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表 1中例 5） 。7.5 若所有稀释度的平均菌落数均不在 30 个300 个之间，其中一个稀释度大于 300 个，而相邻的另一稀释度|小于 30 个时，则以 30 或 300 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表 1 中例 6） 。7.6 若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每 g 或每 mL 小于 10 CFU。7.7 菌落计数的报告，菌落数在 10 以内时，按实有数值报告之，大于 100 时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用 10 的指数来表示（见表 1 报告方式栏） 。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。表 1 细菌计数结果及报告方式不同稀释度平均菌落数例次10-1 10-2 10-3两稀释度菌数之比菌落总数(CFU/mL 或CFU/g）报告方式(CFU/mL 或 CFU/g）1 1365 164 20 16400 16000 或 1.6×1042 2760 295 46 1.6 38000 38000 或 3.8×1043 2890 271 60 2.2 27100 27000 或 2.7×1044 不可计 4650 513 513000 510000 或 5.1×1055 27 11 5 270 270 或 2.7×1026 不可计 305 12 30500 31000 或 3.1×1047 0 0 0 1×10 1×10*CFU：菌落形成单位。三、粪大肠菌群1.范围本规范规定了化妆品中粪大肠菌群的检验方法。本规范适用于化妆品中粪大肠菌群的检验。2.定义本规范采用下列定义粪大肠菌群（Fecal coliforms）系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌，在 44±0.5培养 24h48h能发酵乳糖产酸并产气。该菌直接来自粪便，是重要的卫生指标菌。3.仪器3.1 恒温水浴箱或隔水式恒温箱：44±0.5。3.2 温度计。3.3 显微镜。3.4 载玻片。3.5 接种环。3.6 电磁炉。3.7 三角瓶，250mL。3.8 试管：15×150mm。3.9 小倒管。|3.10 pH 计或 pH 试纸。3.11 高压灭菌器。3.12 灭菌吸管，10mL、1mL。3.13 灭菌平皿：直径 90mm。4.培养基和试剂4.1 双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基成分：蛋白胨 40g猪胆盐 10g乳糖 10g0.4%溴甲酚紫水溶液 5mL卵磷脂 2g吐温 80 14g蒸馏水 1000mL制法：将卵磷脂、吐温 80 溶解到少量蒸馏水中。将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解到其余的蒸馏水中，加到一起混匀，调 pH 到 7.4,加入 0.4%溴甲酚紫水溶液，混匀，分装试管（每支试管中加一个小倒管） 。68.95kPa (115 10 lb)20min 高压灭菌。4.2 伊红美蓝（EMB）琼脂成分：蛋白胨 10g乳糖 10g磷酸氢二钾 2g琼脂 20g2%伊红水溶液 20mL0.5%美蓝水溶液 13mL蒸馏水 1000mL制法：先将琼脂加到 900mL 蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾、蛋白胨，混匀，使之溶解。再以蒸馏水补足至 1000mL。校正 pH 值为 7.27.4,分装于三角瓶内，103.43kPa (121 15 lb)15min 高压灭菌备用。临用时加入乳糖并加热融化琼脂。冷至 60左右无菌操作加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀。倾注平皿备用。4.3 蛋白胨水（做靛基质试验用）成分：蛋白胨（或胰蛋白胨） 20g氯化钠 5g蒸馏水 1000mL制法：将上述成分加热融化，调 pH 值为 7.07.2.分装小试管，103.43kPa (121 15 lb)15min 高压灭菌。4.4 靛基质试剂柯凡克试剂：将 5g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 75mL 戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸 25mL。试验方法：接种细菌于蛋白胨水中，于 44±0.5培养 24h±2h。沿管壁加柯凡克试剂 0.3mL0.5mL，轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。注：蛋白胨应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。4.5 革兰氏染色液：4.5.1 染液制备4.5.1.1 结晶紫染色液：结晶紫 1g|95%乙醇 20mL1%草酸铵水溶液 80mL将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。4.5.1.2 革兰氏碘液：碘 1g碘化钾 2g蒸馏水加至 300mL将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至 300mL。4.5.1.3 脱色液：95%乙醇。4.5.1.4 复染液：（1）沙黄复染液：沙黄 0.25g95%乙醇 10mL蒸馏水 90mL将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。（2）稀石碳酸复红液：称取碱性复红 10g，研细，加 95%乙醇 100mL,放置过夜，滤纸过滤。取该液 10mL,加 5%石碳酸水溶液 90mL,混合，即为石碳酸复红液。再取此液 10mL 加水 90mL,即为稀石碳酸复红液。4.5.2 染色法4.5.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染 1min,水洗。4.5.2.2 滴加革兰氏碘液，作用 1min,水洗。4.5.2.3 滴加 95%乙醇脱色，约 30s,或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色 10s,水洗。4.5.2.4 滴加复染液，复染 1min,水洗，待干，镜检。4.5.3 染色结果革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。注：如用 1：10 稀释石碳酸复红液做复染，复染时间仅需 10s。5.操作步骤5.1 取 10mL 1：10 稀释的检液，加到 10mL 双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基中，置 44±0.5培养箱中培养 24h48h，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。5.2 如产酸产气，则划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置 36±1培养 18h24h。同时取该培养液 12 滴接种到蛋白胨水中，置 44±0.5培养 24h±2h。经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为粪大肠菌群，应注意挑选。5.3 挑取上述可疑菌落，涂片做革兰氏染色镜检。5.4 在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约 0.5mL,观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。6.检验结果报告根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。|四、铜绿假单胞菌1.范围本规范规定了化妆品中铜绿假单胞菌的检验方法。本规范适用于化妆品中铜绿假单胞菌的检验。2.定义本规范采用了下列定义铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在 42±1条件下能生长。该菌对人有致病力，可使伤处化脓，引起败血症等。3.仪器3.1 培养箱：42±1、36±1。3.2 三角瓶，250mL。3.3 试管：15×150mm。3.4 灭菌平皿：直径 90mm。3.5 灭菌刻度吸管，10mL、1mL。3.6 显微镜。3.7 载玻片。3.8 接种针，接种环。3.9 电磁炉。3.10 高压灭菌器。4.培养基和试剂4.1 SCDLP 液体培养基见总则中 3.2。4.2 十六烷基三甲基溴化铵培养基成分：牛肉膏 3g蛋白胨 10g氯化钠 5g十六烷基三甲基溴化铵 0.3g琼脂 20g蒸馏水 1000mL制法：除琼脂外，将上述成分混合加热溶解，调 pH 为 7.47.6,加入琼脂，68.95kPa (115 10 lb)20min 灭菌后，制成平板备用。4.3 乙酰胺培养基成分：乙酰胺 10.0g氯化钠 5.0g无水磷酸氢二钾 1.39g无水磷酸二氢钾 0.73g硫酸镁（MgSO 4.7H2O） 0.5g酚红 0.012g|琼脂 20g蒸馏水 1000mL制法：除琼脂和酚红外，将其它成分加到蒸馏水中，加热溶解，调 pH 为 7.2,加入琼脂、酚红，103.43kPa (121 15 lb)20min 高压灭菌后，制成平板备用。4.4 绿脓菌素测定用培养基成分：蛋白胨 20g氯化镁 1.4g硫酸钾 10g琼脂 18g甘油（化学纯） 10g蒸馏水 1000mL制法：将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中，加温使其溶解，调 pH 至 7.4,加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，68.95kPa (115 10 lb)20min 高压灭菌后，制成斜面备用。4.5 明胶培养基成分： 牛肉膏 3g蛋白胨 5g明胶 120g蒸馏水 1000mL制法：取各成分加到蒸馏水中浸泡 20min,随即搅拌加温使之溶解，调 pH 至 7.4,分装于试管内，经 68.95kPa (115 10 lb)20min 高压灭菌后，直立制成高层备用。4.6 硝酸盐蛋白胨水培养基成分：蛋白胨 10g酵母浸膏 3g硝酸钾 2g亚硝酸钠 0.5g蒸馏水 1000mL制法：将蛋白胨和酵母浸膏加到蒸馏水中，加热使之溶解，调 pH 为 7.2,煮沸过滤后补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中，68.95kPa (115 10 lb)20min 高压灭菌后备用。4.7 普通琼脂斜面培养基成分：蛋白胨 10g牛肉膏 3g氯化钠 5g琼脂 15g蒸馏水 1000mL制法：除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调 pH 为 7.27.4,加入琼脂，加热溶解，分装试管，103.43kPa (121 15 lb)20min 高压灭菌后，制成斜面备用。5.操作步骤5.1 增菌培养：取 1：10 样品稀释液 10mL 加到 90mLSCDLP 液体培养基中，置 36±1培养 18h24h。如有铜绿假单胞菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。5.2 分离培养：从培养液的薄膜处挑取培养物，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，置 36±1培|养 18h24h。凡铜绿假单胞菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略在蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素，此培养基选择性强，大肠埃希氏菌不能生长，革兰氏阳性菌生长较差。在缺乏十六烷三甲基溴化铵琼脂时也可用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平板上，置 36±1培养24h±2h，铜绿假单胞菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其它菌落不生长。5.3 染色镜检：挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。5.4 氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取铜绿假单胞菌可疑菌落涂在滤纸上，然后在其上滴加一新配制的 1%二甲基对苯二胺试液，在 15s30s 之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性；若培养物不变色，为氧化酶试验阴性。5.5 绿脓菌素试验：取可疑菌落 2 个3 个，分别接种在绿脓菌素测定培养基上，置 36±1培养 24h±2h,加入氯仿 3mL5mL,充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入 1mol/L 的盐酸 1mL 左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。5.6 硝酸盐还原产气试验：挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在硝酸盐蛋白胨水培养基中，置 36±1培养 24h±2h,观察结果。凡在硝酸盐蛋白胨水培养基内的小倒管中有气体者，即阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。5.7 明胶液化试验，取铜绿假单胞菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置 36±1培养24h±2h,取出放冰箱 10min30min,如仍呈溶解状或表面溶解时即为明胶液化试验阳性；如凝固不溶者为阴性。5.8 42生长试验：挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在 42±1培养箱中，培养 24h48h,铜绿假单胞菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。6.检验结果报告被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和 42生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。五、金黄色葡萄球菌1.范围本规范规定了化妆品中金黄色葡萄球菌的检验方法。本规范适用于化妆品中金黄色葡萄球菌的检验。2.定义本规范采用下列定义金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽孢，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。该菌是葡萄球菌中对人类致病力最强的一种，能引起人体局部化脓性病灶，严重时可导致败血症。3.仪器和设备3.1 显微镜。3.2 恒温培养箱：36±1。3.3 离心机。|3.4 灭菌吸管，1mL、10mL。3.5 灭菌试管：15×150mm。3.6 载玻片。3.7 酒精灯。4.培养基和试剂4.1 SCDLP 液体培养基见总则中 3.2。4.2 7.5%的氯化钠肉汤成分：蛋白胨 10g牛肉膏 3g氯化钠 75g蒸馏水加至 1000mL制法：将上述成分加热溶解，调 pH 为 7.4,分装，103.43kPa (121 15 lb)15min 高压灭菌。4.3 Baird Parker 氏培养基成分：胰蛋白胨 10g牛肉膏 5g酵母浸膏 1g丙酮酸钠 10g甘氨酸 12g氯化锂（LiCl·6H 2O） 5g琼脂 20g蒸馏水 950mLpH 7.0±0.2增菌剂的配制：30%卵黄盐水 50mL 与除菌过滤的 1%亚碲酸钾溶液 10mL 混合，保存于冰箱内。制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸完全溶解，冷至 25±1校正 pH。分装每瓶 95mL,103.43kPa (121 15 lb)高压灭菌 15min。临用时加热溶化琼脂，每 95mL 加入预热至 50左右的卵黄亚碲酸钾增菌剂 5mL，摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱贮存不得超过 48h±2h。4.4 血琼脂培养基成分：营养琼脂 100mL脱纤维羊血（或兔血） 10mL制法：将营养琼脂加热融化，待冷至 50左右无菌操作加入脱纤维羊血，摇匀，制成平板，置冰箱内备用。4.5 甘露醇发酵培养基成分：蛋白胨 10g氯化钠 5g甘露醇 10g牛肉膏 5g0.2%麝香草酚蓝溶液 12mL蒸馏水 1000mL制法：将蛋白胨、氯化钠、牛肉膏加到蒸馏水中，加热溶解，调 pH 7.4，加入甘露醇和指示剂，混匀后分装试管中，68.95kPa (115 10 lb)20min 灭菌备用。