急性毒性试验讲解.ppt

动物急性毒性试验动物急性毒性试验2020/12/192020/12/19 一、一、概念及意义概念及意义二、二、基本原则基本原则三、研究内容三、研究内容 四、数据分析及评价四、数据分析及评价目目目目 录录录录 五、急性毒性试验常用试验方法五、急性毒性试验常用试验方法 2020/12/192020/12/19动物急性毒性试验：研究动物一次或动物急性毒性试验：研究动物一次或24小时内多次给予受试物后，一小时内多次给予受试物后，一定时间内所产生的毒性反应。定时间内所产生的毒性反应。急性毒性试验对阐明药物的毒性作用和了解其毒性靶器官具有重要意义。急性毒性试验对阐明药物的毒性作用和了解其毒性靶器官具有重要意义。急性毒性试验所获得的信息对长期毒性试验剂量的设计和某些药物临床急性毒性试验所获得的信息对长期毒性试验剂量的设计和某些药物临床试验起始剂量的选择具有重要参考价值。试验起始剂量的选择具有重要参考价值。一一、急性毒性试验的概念及意义、急性毒性试验的概念及意义二、二、急性毒性试验的基本原则急性毒性试验的基本原则1 急性毒性试验设计遵照化学药物急性毒性试验技术指导原则急性毒性试验设计遵照化学药物急性毒性试验技术指导原则 进行试验设计进行试验设计2 具体问题具体分析具体问题具体分析 应根据化合物的结构特点、理化性质、适应症特点和试验目的等选择合理的试应根据化合物的结构特点、理化性质、适应症特点和试验目的等选择合理的试验方法，设计适宜的试验方案，并结合其它药理毒理研究信息对试验结果进行验方法，设计适宜的试验方案，并结合其它药理毒理研究信息对试验结果进行全面的评价全面的评价3 随机、对照、重复随机、对照、重复 急性毒性试验应符合一般动物试验的基本原则，即随机、对照和重复急性毒性试验应符合一般动物试验的基本原则，即随机、对照和重复三、三、研究内容研究内容1 受试药物受试药物 受试药物：制备工艺稳定、符合临床试验用质量标准规定的样品。受试药物：制备工艺稳定、符合临床试验用质量标准规定的样品。注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，并附有研制单位的自检报告。并附有研制单位的自检报告。研究内容研究内容动物选择动物选择1、种属、种属大鼠和小鼠毒性反应基本相似，大鼠和小鼠毒性反应基本相似，但犬科与啮齿科动物存在很大但犬科与啮齿科动物存在很大 差别。小鼠致死剂量明显大于犬类动物，差别。小鼠致死剂量明显大于犬类动物，犬和啮齿类之间的差异在犬和啮齿类之间的差异在5 倍以上。倍以上。为了获得更全面的安全性信息，试验应至为了获得更全面的安全性信息，试验应至少采用两种品系的动少采用两种品系的动 物：一种啮齿类和一种非啮齿类（常用狗或猴物：一种啮齿类和一种非啮齿类（常用狗或猴）。）。急性毒性试验一般不使用家兔。急性毒性试验一般不使用家兔。大鼠大鼠小鼠小鼠 研究内容研究内容2.数量：通常使用数量：通常使用3-5个剂量组（包括阴性对照组），每组小动物数量一般大于大动物。个剂量组（包括阴性对照组），每组小动物数量一般大于大动物。啮齿类每种动物应不少于啮齿类每种动物应不少于5只，非啮齿类不少于只，非啮齿类不少于2只。只。3.性别：通常采用两种性别的动物进行试验，雌雄各半。性别：通常采用两种性别的动物进行试验，雌雄各半。4.年龄：健康成年动物年龄：健康成年动物5.体重：动物初始体重不应超过或低于平均体重的体重：动物初始体重不应超过或低于平均体重的20%。6.动物应符合国家有关规定的等级要求，来源、品系、遗传背景清楚，并具有实验动动物应符合国家有关规定的等级要求，来源、品系、遗传背景清楚，并具有实验动物质量合格证。物质量合格证。研究内容研究内容给药途径给药途径 通常，给药途径应至少包括临床拟用途径和一种能使原形药物较完全进入循环的途径（如静脉注通常，给药途径应至少包括临床拟用途径和一种能使原形药物较完全进入循环的途径（如静脉注射）。如果临床拟用途径为静脉给药，则仅此一种途径即可。射）。如果临床拟用途径为静脉给药，则仅此一种途径即可。经口给药，动物一般应先进行一段时间的禁食（通常一夜，不禁水）。因为胃内容物会影响受试物经口给药，动物一般应先进行一段时间的禁食（通常一夜，不禁水）。因为胃内容物会影响受试物的给药容量，而啮齿类动物禁食时间的长短会影响的给药容量，而啮齿类动物禁食时间的长短会影响到药物代谢酶的活性和受试物到药物代谢酶的活性和受试物肠道内吸收，从而影响毒性肠道内吸收，从而影响毒性的暴露。的暴露。研究内容研究内容给药剂量水平给药剂量水平 急性毒性试验的重点在于观察动物出现的毒性反应。给药剂量应从未见毒性剂量急性毒性试验的重点在于观察动物出现的毒性反应。给药剂量应从未见毒性剂量到出现严重毒性到出现严重毒性(危及生命的危及生命的)剂量，同时设空白和剂量，同时设空白和/或溶媒（辅料）对照组。或溶媒（辅料）对照组。观察时间及指标观察时间及指标 给药后，一般连续观察至少给药后，一般连续观察至少14天，观察的间隔和频率应适当，以便能观察到天，观察的间隔和频率应适当，以便能观察到毒性反应出现的时间及其恢复时间、动物死亡时间等。毒性反应出现的时间及其恢复时间、动物死亡时间等。研究内容研究内容观察的指标：观察的指标：包括一般指标（如动物外观、行为、对刺激的反应、分泌物、排泄物等）、动包括一般指标（如动物外观、行为、对刺激的反应、分泌物、排泄物等）、动物死亡情况（死亡时间、濒死前反应等）、动物体重变化（给药前、试验结束物死亡情况（死亡时间、濒死前反应等）、动物体重变化（给药前、试验结束处死动物前各称重一次，观察期间可多次称重）等。记录所有的死亡情况、出处死动物前各称重一次，观察期间可多次称重）等。记录所有的死亡情况、出现的症状，以及症状起始的时间、严重程度、持续时间等。现的症状，以及症状起始的时间、严重程度、持续时间等。研究内容研究内容病理学检查病理学检查 所有的试验动物均应进行大体解剖，包括试验过程中因濒死而处死的动物、死所有的试验动物均应进行大体解剖，包括试验过程中因濒死而处死的动物、死亡的动物以及试验结束时仍存活的动物。任何组织器官出现体积、颜色、质地亡的动物以及试验结束时仍存活的动物。任何组织器官出现体积、颜色、质地等改变时，均应记录并进行组织病理学检查。等改变时，均应记录并进行组织病理学检查。四、四、数据分析及评价数据分析及评价1 根据所观察到的各种反应出现的时间、严重程度、持续时间等，分析各种反应在根据所观察到的各种反应出现的时间、严重程度、持续时间等，分析各种反应在不同剂量时的发生率、严重程度。根据观察结果归纳分析，判断每种反应的剂不同剂量时的发生率、严重程度。根据观察结果归纳分析，判断每种反应的剂量反应及时间反应关系。量反应及时间反应关系。数据分析及评价数据分析及评价2、判断出现的各种反应可能涉及的组织、器官或系统等。、判断出现的各种反应可能涉及的组织、器官或系统等。3、根据大体解剖中肉眼可见的病变和组织病理学检查的结果，初步判断可能的毒、根据大体解剖中肉眼可见的病变和组织病理学检查的结果，初步判断可能的毒性靶器官。组织病理学检查应附有病理学检查负责人签名和药品注册申请人盖性靶器官。组织病理学检查应附有病理学检查负责人签名和药品注册申请人盖章的报告及有病变组织的病理照片章的报告及有病变组织的病理照片五、急性毒性试验常用试验方法五、急性毒性试验常用试验方法1、近似致死剂量法、近似致死剂量法 该方法主要用于非啮齿类的动物试验。该方法主要用于非啮齿类的动物试验。2、最大给药量法、最大给药量法 对于某些低毒的受试物可采用该方法。在合理的最大给药浓度及给药容量的前提下，对于某些低毒的受试物可采用该方法。在合理的最大给药浓度及给药容量的前提下，以允许的最大剂量单次给药或以允许的最大剂量单次给药或24小时内多次给药小时内多次给药(剂量一般不超过剂量一般不超过5g/kg体重体重)，观察动物出现的反应。一般使用观察动物出现的反应。一般使用10-20只动物，连续观察只动物，连续观察14天。天。急性毒性试验常用试验方法急性毒性试验常用试验方法3、固定剂量法（、固定剂量法（Fixed-dose procedure）以明显的毒性体征作为终点进行评价。以明显的毒性体征作为终点进行评价。试验选择试验选择5、50、500和和2000mg/kg四个固定剂量进行试验，特殊情况下可增加四个固定剂量进行试验，特殊情况下可增加5000 mg/kg剂量。实验动物首选大鼠，给药前禁食剂量。实验动物首选大鼠，给药前禁食6-12小时，给受试物后再禁食小时，给受试物后再禁食3-4小时。采用一次给药的方式进行。小时。采用一次给药的方式进行。若无有关资料可作参考时，可用若无有关资料可作参考时，可用500mg/kg作为初始剂量进行预试，如无毒性反应，作为初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用则用2000 mg/kg进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束预试。如初始剂量出进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束预试。如初始剂量出现严重的毒性反应，即降低一个档次的剂量进行预试，如此时动物存活，就在此两现严重的毒性反应，即降低一个档次的剂量进行预试，如此时动物存活，就在此两个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。每个剂量给一只动物，预试一般不超过个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。每个剂量给一只动物，预试一般不超过5只动物。每个剂量试验之间至少应间隔只动物。每个剂量试验之间至少应间隔24小时。给受试物后的观察期至少小时。给受试物后的观察期至少7天，如天，如动物的毒性反应到第动物的毒性反应到第7天仍然存在，尚应继续观察天仍然存在，尚应继续观察7天。天。在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量至少用在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量至少用10只动物，雌雄各半。根据只动物，雌雄各半。根据预试的结果，在上述四种剂量中选择一个可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量预试的结果，在上述四种剂量中选择一个可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量进行试验，如预试结果表明，进行试验，如预试结果表明，5.0mg/kg引起死亡，则降低一个剂量档次进行试引起死亡，则降低一个剂量档次进行试验验急性毒性试验常用试验方法急性毒性试验常用试验方法急性毒性试验常用试验方法急性毒性试验常用试验方法4、上下法（阶梯法，序贯法，、上下法（阶梯法，序贯法，Up and down method）该方法由该方法由Dixon和和Mood首次提出，首次提出，1985年年Bruce又进行了改进，目前是又进行了改进，目前是OECD（Organization for Economic Co-operation and Development）和）和EPA（Environmental Protection Agency）推荐的）推荐的方法之一。其最大的特点是节省实验动物，同时，不但可以进行毒性表现的观察，方法之一。其最大的特点是节省实验动物，同时，不但可以进行毒性表现的观察，还可以估算还可以估算LD50及其可信限，适合于能引起动物快速死亡的药物。该方法分为及其可信限，适合于能引起动物快速死亡的药物。该方法分为限度试验和主试验。限度试验和主试验。一、限度试验：是最多用一、限度试验：是最多用5只动物进行的序列试验。只动物进行的序列试验。试验剂量为试验剂量为2000 mg/kg，特殊情况下也可使用特殊情况下也可使用5000 mg/kg。1）2000 mg/kg剂量水平的限度试验剂量水平的限度试验：（动物数：（动物数n=5）受试物受试物1只只死亡死亡主试主试验验存活存活其余其余4只只观察观察是否在观察期死亡是否在观察期死亡1只在试验后期死亡，其他动物存活，应停止对其他动物给药，对所有动物进行观察，是否在相似观察期间也发生死亡。急性毒性试验常用试验方法急性毒性试验常用试验方法急性毒性试验常用试验方法急性毒性试验常用试验方法1.有有3只或只或3只以上动物死亡时，只以上动物死亡时，LD50小于小于2000mg/kg；2.有有3只或只或3只以上动物存活时，只以上动物存活时，LD50大于大于2000 mg/kg；3.如果有如果有3只动物死亡，则进行主试验。只动物死亡，则进行主试验。后期死亡的动物应与其他死亡的动物同样计数，后期死亡的动物应与其他死亡的动物同样计数，评价方法5000mg/kg剂量水平的限度试验剂量水平的限度试验:特殊情况下，可考虑使用特殊情况下，可考虑使用5000 mg/kg的剂量。的剂量。1有有3只或只或3只以上动物死亡时，只以上动物死亡时，LD50小小 于于5000 mg/kg；2.有有3只或只或3只以上动物存活时，只以上动物存活时，LD50大于大于 5000 mg/kg。急性毒性试验常用试验方法急性毒性试验常用试验方法主试验主试验1.第一只动物的给药剂量低于第一只动物的给药剂量低于LD50的最接近的估计值。如果该动物存活，第二只动物给予高的最接近的估计值。如果该动物存活，第二只动物给予高一级剂量；两只动物间应间隔至少一级剂量；两只动物间应间隔至少48h.2.如果第一只动物死亡或出现濒死状态，第二只动物给予低一级剂量。如果第一只动物死亡或出现濒死状态，第二只动物给予低一级剂量。剂量级数因子应选定为：剂量级数因子应选定为：1/（剂量（剂量-反应曲线斜率估计值）的反对数（对应于斜率反应曲线斜率估计值）的反对数（对应于斜率2的级数因子为的级数因子为3.2）当没有受试物的斜率的有关资料时，使用当没有受试物的斜率的有关资料时，使用3.2为剂量级数因子。为剂量级数因子。使用默认级数因子时，剂量应从以下序列中选择：使用默认级数因子时，剂量应从以下序列中选择：1.75、5.5、17.5、55、175、550、2000 mg/kg（或有特殊要求时（或有特殊要求时1.75、5.5、17.5、55、175、550、1750、5000 mg/kg）急性毒性试验常用试验方法急性毒性试验常用试验方法5、累积剂量设计法（金字塔法，、累积剂量设计法（金字塔法，Pyramiding dosage design）在非啮齿类动物进行急性毒性试验可采用此方法。经典的试验设计需要在非啮齿类动物进行急性毒性试验可采用此方法。经典的试验设计需要8只动物，只动物，分对照组和给药组，每组分对照组和给药组，每组4只动物，雌雄各只动物，雌雄各2只。只。剂量的设计可以是剂量的设计可以是1、3、10、30、100、300、1000、3000 mg/kg，也可以采用也可以采用10、20、40、80、160、320、640、1280 mg/kg，通常，通常隔日给予下一个高剂量，剂量逐渐加大，直到出现动物死亡时或达到剂量上限隔日给予下一个高剂量，剂量逐渐加大，直到出现动物死亡时或达到剂量上限时为止。时为止。急性毒性试验常用试验方法急性毒性试验常用试验方法6、半数致死量法、半数致死量法 是一种经典的急性毒性试验方法，试验结果经统计学处理可获得受试物的是一种经典的急性毒性试验方法，试验结果经统计学处理可获得受试物的LD50急性毒性试验常用试验方法急性毒性试验常用试验方法Example Example 半数致死量法半数致死量法 经口急性毒性试验材料和试剂材料和试剂u实验动物：健康小鼠实验动物：健康小鼠u器器 材：材：小鼠灌胃针、电子天平小鼠灌胃针、电子天平 动物体重计、外科剪刀和镊子动物体重计、外科剪刀和镊子 u试试 剂：受试物剂：受试物实验步骤 秤体重秤体重编号编号分组分组（随机数字表法）（随机数字表法）灌胃操作灌胃操作中毒症状观察和死亡纪录中毒症状观察和死亡纪录实验动物实验动物预实验预实验组数和剂量组数和剂量确定大致的确定大致的LDLD0 0和和LDLD100100计算计算LDLD5050确定组距的方法d=d=lgLDlgLD100100 lgLD lgLD0 0n-1n-1式中：式中：d d：为组距：为组距（相邻两个剂量组对数剂量之差）（相邻两个剂量组对数剂量之差）n n：为设计时确定的剂量组数：为设计时确定的剂量组数急性毒性实验记录 受试物受试物 名称：名称：提供单位：提供单位：染毒剂量：染毒剂量：mg/kg mg/kg 染毒途径：染毒途径：动物种属品系：动物种属品系：动物来源：动物来源：合格证号：合格证号：室温：室温：相对湿度：相对湿度：组别组别染毒剂量染毒剂量(mg/kg)(mg/kg)动物编号动物编号性性别别体重体重(g)(g)染毒染毒时间时间症状症状及出现时间及出现时间死亡死亡时间时间体重记录(g)LD50LD50及其及其95%95%可信限（可信限（FLFL）计算）计算u 改良寇氏法计算改良寇氏法计算-最大剂量的对数值-最大剂量的对数值最大剂量的对数值最大剂量的对数值最大剂量的对数值i-相邻剂量比值的对数；p-各组剂量的死亡率；q-各组剂量的存活率 i-i-相邻剂量比值的对数；相邻剂量比值的对数；相邻剂量比值的对数；相邻剂量比值的对数；p-p-各组剂量的死亡率；各组剂量的死亡率；各组剂量的死亡率；各组剂量的死亡率；q-q-各组剂量的存活率各组剂量的存活率各组剂量的存活率各组剂量的存活率各组死亡率之和；n-各组动物数；Pm-最高死亡率；Pn-最低死亡率；-的标准差。各组死亡率之和；各组死亡率之和；各组死亡率之和；各组死亡率之和；n-n-各组动物数；各组动物数；各组动物数；各组动物数；Pm-Pm-最高死亡率；最高死亡率；最高死亡率；最高死亡率；Pn-Pn-最低死亡率；最低死亡率；最低死亡率；最低死亡率；的标准差的标准差的标准差的标准差校正式校正式校正式校正式 急性毒性评价 根据实验动物的中毒症状、出现死亡的时间和根据实验动物的中毒症状、出现死亡的时间和LDLD5050，参照化学物质毒性，参照化学物质毒性分级标准，评价受试物的急性毒性大小及毒性特征。分级标准，评价受试物的急性毒性大小及毒性特征。欢迎批评指正！欢迎批评指正！