啤酒微生物检测手册.doc

啤酒检验手册（微生物检验部分）1目录A、半成品质量检验一、冷麦汁2二、发酵酒2三、贮酒 4四、一滤酒 6五、清酒7B、成品质量检验8C、原辅材料质量检验13附录 1：培养基、中和剂及染色剂的配制和染色方法15附录 2：玻璃器皿的洗涤、包扎与灭菌19附录 3：无菌吸样要求19附录 4：大肠菌群最可能数（MPN）检索表202A、半成品质量检验一、冷麦汁1、 抽样方法1.1传统发酵1.1.1 每班至少抽检一批。1.1.2 取样时先打开取样阀排放少量液体，后用 70-75%的酒精由内至外消毒取样阀，再用火焰灭菌（酒精火焰外焰灼烧 15 秒以上）。重新打开阀门排放样品，待阀门冷却后，取 150200ml 入已灭菌的三角瓶。1.2锥形罐发酵逐批抽检，取样方法同 A一、1.1.22、检验项目好气菌（每班至少抽检一批）厌气菌（每天至少抽检一批，原则上由日班完成）注：停产搞卫生后的第一批麦汁一定要抽样检验好气菌和厌气菌。3、检验方法3.1 好气菌：无菌操作吸取 1ml 样品加入已灭菌的平皿内，及时将冷却至 45±1（手感不烫手）的营养琼脂培养基注入平皿 10-15ml，并转动平皿使混合均匀。待琼脂凝固后，翻转平板，置 36±1 的电热恒温培养箱内培养 24 或 48±2 小时后，在菌落计数器上计菌落总数，结果即是每毫升样品中所含的好气菌数。3.2 厌气菌：无菌操作吸取 1ml 样品加入已灭菌的平皿内，及时将冷却至 45±1的 UBAD（或 NBBD）培养基注入平皿 10-15ml，并转动平皿使混合均匀。待培养基凝固后，翻转平板，置 25±1 的厌氧培养箱内培养 57 天后，在菌落计数器上计菌落总数，结果即是每毫升样品中所含的厌气菌数。4、结果处理4.1 检验结果以电脑报告单或书面报告单的形式报给企业领导、生技部和酿造部。二、发酵酒1、 抽样方法1.1传统发酵1.1.1 0 代的酵母，半罐即取样；满罐 1 小时后再取样。 1 代以上（包括 1 代）的酵母满罐 1 小时后取样。 取样时先打开取样阀排放少量液体，后用 70-75%的酒精由内至外消毒取样阀，再用火焰灭菌（酒精火焰外焰灼烧 15 秒以上）。重新打开阀门排放样品，待阀门冷却后，取 150200ml 入已灭菌的三角瓶。1.1.2 满罐 56 小时后再取前酵液 150200ml 检测高泡时期的酵母数。31.2锥形罐发酵1.2.1 0 代的酵母，添加第一批麦汁后 1 小时及满罐后 1 小时取样；1 代以上（包括 1 代）的酵母满罐 1 小时后取样。无菌操作取样，方法同 A 一、1.1.2。1.2.2 满罐的第四日取样检测厌氧菌，方法同 A 一、1.1.2。1.2.3 满罐的第 20 日取发酵液 150200ml 检测酵母数和死亡率。2、检验项目2.1传统发酵2.1.1 每罐检验项目：酵母数、出芽率、酵母形态及厌气菌；高泡期酵母数。2.1.2 抽检项目：0 代酵母逐罐检验死亡率及好气菌；1 代以上（包括 1 代）每月至少抽 4 罐检验好气菌及死亡率。2.2锥形罐发酵2.2.1 每罐检验项目：酵母数、出芽率、死亡率、酵母形态、好气菌及厌气菌；2.2.2 抽检项目：20 天后的酵母数；（0 代的酵母逐罐检验，0 代以上的酵母抽检的罐数不少于当日满罐总数的 50%）20 天后的死亡率（0 代的酵母逐罐检验，0 代以上的酵母每月至少抽检 4 罐）3、检验方法3.1 好气菌：同 A、一、3.1 中好气菌的检验方法3.2 厌气菌：同 A、一、3.2 中厌气菌的检验方法3.3 酵母形态与死亡率：取 1:5000的美蓝染色液一滴，滴在一块洁净的载玻片中央，用滴管或玻棒加一滴酵母悬浮液，混合均匀，染色 3分钟后盖上盖玻片制成水浸片，镜检（在 3分钟内用高倍镜观察）。染上蓝色的细胞是死细胞，未着色的是活细胞。用血球分类计算器计出死亡酵母数与酵母细胞总数（检酵母死亡率时，要求每个视野不少于 50 个酵母，数 1000 个以上酵母个数）。同时观察酵母形态，主要观察酵母的形状、大小、内含物、液泡及细胞壁。（单纯观察酵母形态时可以用蒸馏水代替美蓝染色液)死亡酵母数酵母死亡率（%）= ×100 （计算结果保留一位小数）酵母细胞总数3.4 酵母数与出芽率： 3.4.1 计酵母数时一般要求用 2的 H2SO4稀释 10 倍（1ml 酵母液加入 9ml 2%H2SO4），使血球计数板每个小方格中平均 46 个细胞为宜。但酵母含量少时不用稀释。 3.4.2 取一块洁净的血球计数板，在中央计数区的上方加盖一块洁净的盖玻片。3.4.3 用滴管或玻棒取酵母悬浮液滴于盖玻片的边缘，让菌液靠毛细作用渗入计数4室，注意不得有气泡产生。将计数板置于显微镜的载物台上，静止 5 分钟，使酵母细胞全部沉降到计数板的表面。3.4.4 分别统计 5 个中方格（左上、右上、左下、右下、中央）中细胞总数及芽体数，酵母菌的芽在未脱离母细胞前，若已达母细胞的 1/2 大小，则不作为芽体而作为成熟的细胞计数。在计数时，若遇到位于中方格间线上的细胞，只统计位于左线及下线上且在线内的体积不少于一半的细胞。为尽量减少实验误差，对同一样品血球计数板的上下两个划线区域的 5 个中方格（左上、右上、左下、右下、中央）均要计细胞总数及芽体个数，分别取其平均值（酵母细胞总数平均值以 A 表示、芽体个数平均值以 B 表示）。3.4.5 使用完毕后，将血球计数板冲洗干净（绝对不能用硬物洗刷），让其自行晾干。3.4.6 将细胞总数平均值 A 乘以 5 即得 25 个中方格中的细胞总数3.4.7 细胞数/毫升25 个中方格中细胞总数×稀释倍数×10 4，即稀释 10 倍的计算结果是 25 个中方格中细胞总数将其小数向前移 1 位×10 6个/毫升，没稀释的则向前移两位小数。(计算结果保留一位小数)3.4.8 芽体个数（B）出芽率（%）= ×100 (计算结果保留一位小数)细胞总数（A）4、结果处理4.1 检验结果以电脑报告单或书面报告单的形式报给企业领导、生技部和酿造部。三、贮酒（仅对传统发酵）1、抽样方法1.1 满罐后即时取样1.2 取样时先打开取样阀排放少量液体，后用 70-75%的酒精由内至外消毒取样阀，再用火焰灭菌（酒精火焰外焰灼烧 15 秒以上）。重新打开阀门排放样品，待阀门冷却后，取 150200ml 入已灭菌的三角瓶。2、检验项目2.1 厌气菌：每班抽检的罐数不小于当班满罐总数的 50%2.2 好气菌与死亡率：每月至少抽检 4 罐2.3 酵母数：每班抽检的罐数不小于当班满罐总数的 50%3、检验方法3.1 厌气菌：同 A、一、3.2 中厌气菌的检验方法3.2 好气菌：同 A、一、3.1 中好气菌的检验方法3.3 酵母数：53.3.1 同 A、二、3.4.13.3.2 同 A、二、3.4.23.3.3 同 A、二、3.4.33.3.4 分别统计 5 个中方格（左上、右上、左下、右下、中央）中酵母细胞总数，在计数时，若遇到位于中方格间线上的细胞，只统计位于左线及下线上且在线内的体积不少于一半的细胞。为尽量减少实验误差，对同一样品血球计数板的上下两个划线区域的 5 个中方格（左上、右上、左下、右下、中央）均要计数，取其平均值（数值以 A 表示）。3.3.5 将酵母细胞总数平均值 A 乘以 5 即得 25 个中方格中的细胞总数3.3.6 细胞数/毫升25 个中方格中细胞总数×稀释倍数×10 4，即稀释 10 倍的计算结果是 25 个中方格中细胞总数将其小数向前移 1 位×10 6个/毫升，没稀释的则向前移两位小数。计算结果保留一位小数。3.4 死亡率：同 A、二、3.3 中死亡率的检测方法4、结果处理4.1 检验结果以电脑报检单或书面报检单的形式报给企业领导、生技部和酿造部。6四、一滤酒1、 抽样方法1.1 取样方法同 A 一、1.1.22、检验项目：2.1 好气菌：每天日班至少抽检一罐2.2 厌气菌：每周至少抽检一罐3、检验方法3.1 好气菌：同 A 一、1.3.13.2 厌气菌：同 A 一、1.3.24、结果处理4.1 检验结果以电脑报检单或书面报检单的形式报给企业领导、生技部和酿造部7五、清酒1、抽样方法1.1 满罐后即取样。1.2 取样时先打开取样阀排放少量液体，后用 70-75%的酒精由内至外消毒取样阀，再用火焰灭菌（酒精火焰外焰灼烧 15 秒以上）。重新打开阀门排放样品，待阀门冷却后，取 150200ml 入已灭菌的三角瓶。2、检验项目2.1 每罐检验项目：好气菌（60前及 60后）2.2 抽检项目：60后厌气菌（每 10 罐至少检测 1 罐）3、检验方法3.1 好气菌：无菌操作吸取 1ml 清酒加入已灭菌的平皿内，将余下的酒液重新包扎放入电热恒温水浴锅中，60±1恒温 15 分钟模拟杀菌。再吸取已杀菌的酒液 1ml 入已灭菌的平皿。及时将冷却至 45±1的营养琼脂培养基注入平皿 10-15ml，并转动平皿使混合均匀。待琼脂凝固后，翻转平板，置 36±1 的电热恒温培养箱内培养24 或 48±2 小时后，分别在菌落计数器上计菌落总数。3.2 厌气菌：无菌操作吸取已模拟杀菌的酒液 1ml 入已灭菌的平皿。及时将冷却至45±1的 UBA（或 NBB）培养基注入平皿 10-15ml，并转动平皿使混合均匀。待琼脂凝固后，翻转平板，置 25±1 的厌氧培养箱内培养 57 天后，在菌落计数器上计菌落总数，结果即是每毫升酒液中所含的厌气菌数。4、结果处理4.1 检验结果以电脑报告单或书面报告单的形式报给企业领导、酿造部、生技部和包装部。8B、成品质量检验1抽样方法1.1 瓶/罐装酒1.1.1 正常生产情况下，每批取前、中、后期三个酒样；当同一个清酒桶包两条线时，各取前、后期两个酒样。1.1.2 同一批酒，如包装时间超过 8 小时，除按正常取样外，每 3 小时加取 1 个微检样。1.1.3 同一批酒，如包装时间小于 6 小时，则可只取前、中期或前期酒样。1.1.4 如一批酒中有头板酒、PU 或杀菌温度偏低、杀菌运行时间偏短部分，则各取两支酒样。1.1.5 以上酒样均由包装线检验人员提供给微检检验人员。1.2 桶装啤酒1.2.1 同一个清酒桶包出来的桶装啤酒为一批，每批取第三桶作前期酒样；同一个清酒桶的酒未包完而停包 4 个小时以上的，再重包时作另一批，也取第三桶的酒样，由车间通知取样。1.2.2 正常生产情况下，每班至少抽检一桶。2检验项目2.1 瓶/罐装啤酒2.1.1 每支酒检验项目：好气菌（前期要做平行样）2.1.2 抽检项目：活酵母（每批至少抽检前期酒样；640ml 瓶装线使用旧瓶包装时加抽后期酒样，抽检批数不低于当月总批数的 80%）（头板、 PU偏低、杀菌温度偏低、杀菌时间偏短至少抽检一支）大肠菌群（每批至少抽检前期酒样）厌气菌（连续生产时至少批数逢“0”抽检，停产一段时间后包返的第一批要求抽检，每批抽检前期酒样）2.2 桶装啤酒2.2.1 每桶酒检验项目：好气菌（前期要做平行样）活酵母2.2.2 抽检项目：大肠菌群（每批至少抽检前期酒样）厌气菌（连续生产时每 3批至少抽检 1批，停产一段时间后包返的第一批要求抽检，每批抽检前期酒样）3检验方法3.1 好气菌、活酵母与厌气菌3.1.1样品处理3.1.1.1瓶/罐装啤酒：在无菌状态下，用 70-75%的酒精棉抹干净开瓶器、瓶口9（或罐装拉环部分），再用酒精火焰灭菌。无菌操作开启瓶/罐盖，迅速倒出 2/3左右的酒液后马上用酒精棉盖住瓶/罐口，并轻轻摇荡，使 CO2 逸出后备用。3.1.1.2 桶装啤酒：依次用 1%的碘液与 70-75%的酒精棉抹干净酒阀，再用酒精火焰对酒阀及取样器与酒阀接触的部分杀菌，连接好取样器（已用 1%的碘液浸泡灭菌）及酒阀。打开取样阀排放 100-150ml 的酒液，用 70-75%的酒精棉由内至外抹干净取样口，再用酒精火焰灭菌（灼烧 15 秒钟以上），打开取样阀排放液体，待取样口冷却后，无菌操作接取 400500ml 的样品入已灭菌的三角瓶中备用。3.1.2 检验程序：见下图 1： 检样加 1ml入灭菌平皿内平皿内加入适量培养基一定的培养条件与时间菌落计数报告（图 1） 3.1.3 操作步骤无菌操作吸取 1ml 的酒液加入已灭菌的平皿内，及时将冷却至 45±1的培养基注入平皿 10-15ml，并转动平皿使混合均匀。待琼脂凝固后，翻转平板，置培养箱内培养一定时间，在菌落计数器上计菌落总数。3.1.4 培养条件检验项目 培养基 培养条件 培养时间 培养箱好气菌 营养琼脂 36±1 24或 48±2小时电热恒温培养箱活酵母 麦汁琼脂 30±1 48±2小时 电热恒温培养箱厌气菌 UBA或 NBB 25±1 57 天 厌氧培养箱