培养基质量控制作业指导书.doc

培养基质量控制作业指导书文件编号：WLCDC/ZD76511、目的：为加强我中心检验科实验室的工作管理，保证实验室的检测质量，特制定此作业指导书；2、范围：适用于实验室微生物培养基使用前的质量验收、使用过程中的质量控制。3、职责：3.1 检验人员：按照本规程规对培养基使用前及使用过程中进行质量控制，确保培养基符合相关标准的要求。3.2 科室负责人：负责指导、监督检验人员对培养基进行质量控制。4、生产企业提供的材料培养基生产厂家随产品应提供下列文件：培养基、独立成分、添加成分名称；批号；使用前的 pH；储藏信息和有效期；性能评价和所用测试菌株；技术数据清单；质控证书/必要的安全、危害数据。5、验收实验室收到培养基后，应填写“培养基验收检查记录单” ，检查包装及完整性，标识是否清晰等，验收合格后按照“培养基编码系统使用规程”对培养基进行编号。6、 贮存及使用前质量确认6.1 商品化培养基应严格按供应商提供的贮存条件、有效期进行贮存。6.2 验收合格的培养基应建立“商品化干粉培养基目录清单” ，使用前对容器密闭性进行复查。6.3 开封的脱水培养基，每次使用前应对其质量进行检查，通过粉末的流动性、均匀性、结块情况和色泽变化等判断培养基的质量变化。若发现培养基受潮或物理性状发生明显改变则不应再使用。6.4 制备好的成品培养基应建立“ 成品培养基目录清单” ，每次使用前应检查：颜色是否发生变化?/是否蒸发/脱水?/是否有微生物生长 ?等。如果发生上述异常情况，则不应再使用。7、制备好的成品培养基的质量控制新购的不同批次的商品化培养基在使用前应进行培养基性能测试，符合要求后使用。成品培养培养基的质量控制应包括物理指标和微生物指标的测试，根据测试结果及时填写“实验室制备培养基测试结果记录单” 。培养基质量控制作业指导书文件编号：WLCDC/ZD76527、1 物理指标控制1） 测试 2025的 pH 值2）琼脂层厚度；色泽；透明度和（或）是否存在肉眼可见杂质；凝胶稳定性、粘稠度和湿度。7、2 微生物学指标控制可根据要求选用定量方法、半定量方法或定性方法（详见表 1-表）对培养基性能进行测试，具体操作方法详见作业指导书“培养基性能测试指南” 。7、3 微生物污染的控制从每批制备好的培养基中选取至少一个（或 1%）平板或试管，置于 37或按特定标准中规定的温度培养 18h。8、生长特性8、1 生长率将适量测试菌株的工作培养物接种至固体、半固体和液体培养基中，每种培养基上菌株的生长率应达规定的最低限值。1）定量方法生长率 PR的计算： P R = NS/NONS：从一个或多个待测培养基平板上得到的菌落总数。N0：从一个或多个规定的参考培养基平板上获得的菌落总数（该菌落总数应100cfu ） 。要求：非选择性培养基上目标菌的生长率最低应为 0.7，该类培养基应易于目标菌生长；选择性培养基上目标菌的生长率最低应为 0.1；每平板（或每试管）的接种水平为10CFU100CFU。2） 半定量方法半定量方法采用生态测量技术在平板上划线，平板板连续划线区域得分的总和即为生长指数 G，G 值不应超过标准规定的允许范围。3） 定性方法定性方法采用划线法观察。选择性将浓度为 104CFU/mL10 6CFU/mL 的非目标菌工作菌株悬浮液接种至选择培养基和参考培养基中，培养基的选择性应达到规定值。培养基质量控制作业指导书文件编号：WLCDC/ZD7653定量方法选择因子 SF： S F = DO - DSDO：能在参考培养基上生长至少 10 个菌落的最高稀释度DS：能在测试培养基上显示生长的最高稀释度 要求：非目标菌在选择性培养基上的 SF至少为 2 ；半定量和定量法中，非目标菌应部分或全部被抑制。生理生化特性（选择性和特异性）规定培养基的基本特性，使用一套适当的测试菌株对培养基上的目标菌的生理生化特性（菌落形态、大小等）和非目标菌的被抑制程度进行测试。8、2 性能评价和结果解释按照规定得到的所有测试菌株的性能均符合规定，则该批培养基品质优良；若只有物理指标和微生物指标符合规定，则该批培养基可被接收。表 1 计数用选择性培养基培养基 用途 培养条件 测试菌株 参考培 养基 控制方法 判定标准 特征反应生长率 3724-48h 金黄色葡萄球菌ATCC6538/25923 TSA 定量 PR0.5黑色/灰色菌落，周围为一混浊带，其外有透明带选择性 3748h 大肠杆菌ATCC25922/8739 定性 全部抑制 Baird-ParkerS特异性 3724-48h 表皮葡萄球菌 ATCC12228 定性 黑色/灰色菌落，周围为一混浊带，其外无透明带生长率 3024-48h 腊样芽胞杆菌 ATCC11778 TSA 定量 PR0.7 具沉淀带的粉色菌落选择性 3748h 大肠杆菌ATCC25922 定性 全部抑制 MYPS特异性 3748h 枯草芽胞杆菌 ATCC6633 定性 不具沉淀带的粉色菌落培养基质量控制作业指导书文件编号：WLCDC/ZD7654表 2 计数用非选择性培养基培养基 用途 培养条件 测试菌株 参考培 养基 控制方法 判定标准 特征反应大肠杆菌ATCC25922/8739生长率 3724h鼠伤寒沙门菌ATCC14028TSA 定量 PR0.5 带有或不带沉淀带的粉红色或红色菌落VRBG（结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂）S 选择性 3720h粪链球菌ATCC29212/19433 定性 全部抑制 生长率 3020h 大肠杆菌ATCC25922/8739 TSA 定量 PR0.5 带有或不带沉淀带的淡紫色菌落选择性 3020h 粪链球菌ATCC29212/19433 定性 全部抑制 VRBL（紫红胆汁乳糖）S 特异性 3020h 铜绿假单胞菌ATCC27853 定性 - 无色至浅棕色菌落生长率 3724h大肠杆菌O157：H7ATCC43894/43895TSA 定量 PR0.5 透明菌落，表面淡黄棕色，菌落直径约 1mm选择性 3724h 金黄色葡萄球菌ATCC6538/25923 定性 全部抑制 CT-SMAC（改良山梨醇麦康凯琼脂）S 特异性 3724h 大肠杆菌ATCC11775/25922 定性 粉色菌落大肠杆菌ATCC25922/8739生长率弗氏柠檬酸杆菌ATCC25922/8739半定量浊度 2+，导管 1/3产气产气并浑浊BGBLB（煌绿乳糖胆盐肉汤）L 选择性3024-48h粪链球菌ATCC29212/19433TSA定性 不生长 生长率 442448h 大肠杆菌ATCC25922 半定 量浊度 2+，导气管1/3 产气产气并浑浊ECL选择性 442448h 铜绿假单胞菌 ATCC27853b 定性 不生长 生长率 442448h 大肠杆菌ATCC25922 半定 量浊度 2+，导气管1/3 产气产气并浑浊，产生荧光EC-MUG/LS-MUGL 选择性 442448h铜绿假单胞菌ATCC27853b 定性 不生长 生长率 3724h 大肠杆菌ATCC25922 半定 量 导气管1/3 产气 产气并变黄色乳糖胆盐发酵培养L 选择性 3724h 鼠伤寒沙门菌 ATCC14028 定性 不产气、仍为紫色生长率 3724h 大肠杆菌ATCC25922 半定 量 导气管1/3 产气 LST（月桂酸肉汤）L 选择性 3724h 福氏志贺氏菌 CMCC51572 定性 培养基质量控制作业指导书文件编号：WLCDC/ZD7655培养基 用途 培养条 件 测试菌株 参考培 养基 控制方法 判定标准 特征反应大肠杆菌ATCC25922/8739金黄色葡萄球菌ATCC6538PCA（平板计数琼脂）S生长率 3072h枯草芽孢杆菌ATCC6633TSA 定量 PR0.7 表 3 选择性增菌培养基培养基 用途 培养条 件 测试菌株 控制方 法 判定标准 特征反应大肠杆菌ATCC25922/8739生长率 3724h鼠伤寒沙门菌ATCC14028VRBG 上10CFUEEL选择性 粪肠球菌ATCC29212半定量全部抑制粉红至红色菌落，有或没有沉淀带鼠伤寒沙门菌ATCC14028肠炎沙门氏菌ATCC13076生长率41.524h铜绿假单胞菌ATCC27853半定量XLD 或其他选择性培养基上10CFU大肠杆菌ATCC25922 TSA 上全抑制RVSL选择性 41.524h 粪链球菌ATCC29212半定量 TSA 上10CFU鼠伤寒沙门菌ATCC14028+大肠杆菌ATCC25922生长率 3724h+铜绿假单胞菌ATCC27853b半定量XLD 或其他选择性培养基上10CFU不同培养基上菌落特征不同（见标准）大肠杆菌ATCC25922SC(亚硒酸盐胱氨酸)L选择性 3724h 粪链球菌ATCC29212半定量 TSA 上10CFU 鼠伤寒沙门菌ATCC14028生长率 3724h伤寒沙门菌CMCC50071XLD 或其他选择性培养基上10CFU不同培养基上菌落特征不同（见标准）TTB(四硫磺酸钠煌绿增菌液)L 选择性 3724h 大肠杆菌半定量TSA 上 培养基质量控制作业指导书文件编号：WLCDC/ZD7656ATCC25922 10CFU霍乱弧菌CMCC16109生长率 3724h副溶血性弧菌CMCC20001TCBS 或其他选择性培养基上10CFU不同培养基上菌落特征不同（见标准）大肠杆菌ATCC25922/8739碱性蛋白胨水L选择性 3724h 福氏志贺氏菌CMCC51572半定量TSA 上10CFU 7.5%氯化钠肉汤L生长率 3724h 金黄色葡萄球菌 ATCC6538 半定量B-P 平板或其他培养基上10CFU不同培养基上菌落特征不同（见标准）表 4 非选择性增菌培养基培养基 用途 培养条件 测试菌株 控制方法 判定标准 特征反应BHI 生长率 3724h 金黄色葡萄球菌 ATCC6538 定性 浊度 12 大肠杆菌ATCC25922蛋白胨 盐L稀释 202545min 金黄色葡萄球菌ATCC25923定量+/-50%菌落数/至（+/-50%原始菌落数表 4 非选择性增菌培养基（续）培养基 用途 培养条件 测试菌株 控制方法 判定标准 特征反应生长率 3724h 大肠杆菌ATCC25922 定性 导气管 1/3 产气乳糖蛋白胨肉汤L 选择性 3724h鼠伤寒沙门菌ATCC14028 定性 铜绿假单胞菌ATCC27853大肠杆菌ATCC25922SCDLP 液体培养基L生长率 3724h金黄色葡萄球菌ATCC6538定性 浊度 12 液体沙氏培养基L生长率 265 天 白色念珠菌 CMCC98001 定性 浊度 12 真菌培养基L 生长率 265 天白色念珠菌CMCC98001 定性 浊度 12 培养基质量控制作业指导书文件编号：WLCDC/ZD7657表 5 选择性分离培养基培养基 用途 培养条件 测试菌株 控制方法 判定标准 特征反应鼠伤寒沙门菌ATCC14028菌落呈黑色，有金属光泽生长率福氏志贺氏菌CMCC51572良好生长(2)菌落呈棕色大肠杆菌ATCC25922/8739全部或部分抑制（01）无典型菌落亚硫酸酸铋琼脂（BS）S 选择性3748h粪链球菌ATCC29212/19433定性全部抑制（0） -鼠伤寒沙门菌ATCC14028 菌落呈黑色生长率福氏志贺氏菌CMCC51573良好生长(2)菌落呈无色大肠杆菌ATCC25922/8739全部或部分抑制（01）无典型菌落XLDS选择性3724h粪链球菌ATCC29212/19433定性全部抑制（0） -金黄色葡萄球菌ATCC6538/25923 定性 良好生长 溶血，透明溶血环血琼脂平 板S生长率 372448h 粪链球菌ATCC29212 定性 良好生长 溶血,草绿色溶血环霍乱弧菌CMCC16109 定性 良好生长 菌落较大，呈黄色TCBSS 生长率372448h 副溶血性弧菌CMCC20001 定性 良好生长 菌落较大，呈绿色霍乱弧菌CMCC16109 定性 良好生长菌落较大、扁平透明、湿润、中心带有黑色生长率 372448h 非 O1 群霍乱弧菌CMCC17045 定性 良好生长菌落较大、扁平透明、湿润、中心带有黑色4 号琼脂 S选择性 3724h 大肠杆菌ATCC25922/8739 定性全部或部分抑制（01）表 5 选择性分离培养基（续）培养基 用途 培养条件 测试菌株 控制方法 判定标准 特征反应大肠杆菌ATCC25922/8739 定性 良好生长 菌落紫黑色带金属光泽伊红美兰琼脂S生长率 3724h鼠伤寒沙门菌 定性 良好生长 菌落灰白色半透明培养基质量控制作业指导书文件编号：WLCDC/ZD7658ATCC14028福氏志贺氏菌CMCC51573 定性 良好生长 菌落灰白色半透明大肠杆菌ATCC25922/8739 定性 良好生长斜面及底层均变黄，产气，硫化氢阳性普通变形杆菌CMCC49001 定性 良好生长斜面及底层均变黄，产气，硫化氢阳性福氏志贺氏菌CMCC51573 定性 良好生长底层变黄，斜面变红，不产气，硫化氢阴性TSI(三糖铁琼脂)S生长率 3724-48h鼠伤寒沙门菌ATCC14028 定性 良好生长底层变黄，斜面变红，产气，硫化氢阳性表 6 非选择性分离培养基培养基 用途 培养条件 测试菌株 控制方法 判定标准 特征反应大肠杆菌ATCC25922鼠伤寒沙门菌ATCC14028c营养琼脂S生长率 3724h小肠耶尔森氏菌ATCC23715定性 良好生长 (2) -9、记录实验室培养基质控记录 WLCDC/BG 2433培养基质控验收及使用处理情况记录 WLCDC/BG 2439培养基验收检查记录单 WLCDC/BG 2446 商品化培养基目录清单 WLCDC/BG 2447 成品培养基目录清单 WLCDC/BG 2448 10、参考文献6.1 GB/T27405-2008.实验室质量控制规范 食品微生物检测S.6.2 SN/T1538.1-2005.培养基制备指南 第 1 部分：实验室培养基制备质量保证通则S.6.3 SN/T1538.2-2007.培养基制备指南 第 2 部分：培养基性能测实用指南S.