invitrogen trizolrna抽提说明书.doc

RNA抽提全过程(TRIZOL)一， 准备工作1， 实验器具与材料：（1） 移液枪：1ml、200ul、10ul（2） 吸头：1ml、200ul、20ul（3） 吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个（4） EP管1.5ml、100ul（5） 玻璃研磨器（6） 容量瓶：1000ml（7） 盐水瓶：100ml（8） 15ml塑料管一个（配75乙醇用）2， 实验器具的处理与准备（1） 塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37过夜，然后送至高压3次，后在80烘烤箱中烘干（或置于37中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。或直接购买经DEPC处理的枪头和EP管,每盒大约30元,基本上试剂公司都可以购买。（2） 玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）先泡酸过夜，冲洗干净后，在1DEPC水中泡8小时左右，37烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次（或180度干烤）。（3） 金属制品：（镊子等）先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）3， 试剂配制和准备：（1） DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。配75乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37过夜，送至高压。（2） 75乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇1:3），然后放于-20备用。（3） 异丙醇：放入棕色瓶（4） 氯仿：放入棕色瓶（5） Trizol：100ml/瓶 存放于4二， 抽提时注意事项：全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。三， 抽提步骤1 匀浆化作用取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下，室温静置5分钟。2 分离阶段每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室温静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。3 RNA的沉淀将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-500ul），加入0.5ml异丙醇，混匀后放于-20中1小时，后12000rmp离心10分钟。4 RNA的洗脱小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。5 RNA的再溶解小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约30分钟，此时RNA沉淀变透明）。注意不能让RNA沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60下孵育10分钟助溶。6，RNA的保存提取的RNA保存于-70超低温冰箱中，或立即用于逆转录。TRIzol法抽提总RNA组织100mg加1mlTRIzol研磨，匀浆（研磨时倒入液氮，研磨完后从研钵转入EP管中，）（组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管）颠倒混匀10下，室温5分钟加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）颠倒混匀15S，室温5分钟4，离心12000rmp，15分钟转上层水相（约400-500l）于另一新1.5mlEP管中（注意勿吸入中间那层）加等体积异丙醇（约400 -500l）4，离心12000rmp，10分钟弃上清加冰预冷的75%乙醇（用高压后的DEPC水配）1ml4离心7500rmp，5分钟弃上清，超净工作台开风机干燥约30分钟（不能完全干燥）溶于DEPC水中至50l（此处可按照实际情况修改，有人用50，也有人用100）（可在55-60水中，<10分钟助溶）立即保存于-70超低温冰箱中，或立即用于逆转录RNA纯度检测及定量从36l中取6l，用无RNA酶的水稀释100倍至600l，用DU70型分光光度仪分别测定样品在260nm、280nm波长的光密度值，计算出RNA的浓度（g/ml）。纯RNA样品的A260/A280比值为1.7-2.1，若低于此值，表明存在蛋白质污染，需重新用酚/氯仿抽提。RNA样品的A260/A230比值应大于2.0，若低于该标准，提示有变性缓冲液残留需重新用乙醇沉淀RNA，然后用750ml/L的乙醇洗涤，以除去残留的变性缓冲液。RNA电泳用无Rnase水配TAE电泳液，称1.0g新开封的琼脂糖，加TAE电泳液至100ml，煮沸，加溴乙锭20l ，降至室温后灌胶置DEPC水处理过的电泳槽中，凝固20min，加TAE 缓冲液浸没胶块。取15l RNA加6×RNA专用上样缓冲液3l ，混匀，用移液枪将样品加入上样孔内，待溴酚蓝迁移至理想位置后，终止电泳，紫外灯下观察、拍照。上传RNA电泳条带如下最下面条带代表5s色浅代表RNA基本无降解如出现拖把状条带则为降解较严重情况但有时这种情况也可以照样RTPCR我们同学就有在低温冰箱放了几个月的组织照样可以出结果的