食用油中苯并（a）芘快速检测,胶体金免疫层析法（KJ202010）.docx

食用油中苯并（a）芘快速检测,胶体金免疫层析法（KJ202010）附件10 食用油中苯并（a）芘的快速检测 胶体金免疫层析法 (KJ201910) 1 范围 本方法规定了食用油中苯并（a）芘的胶体金免疫层析快速检测方法。 本方法适用于食用油中苯并（a）芘的快速测定。 2 原理 本方法采纳竞争抑制免疫层析原理。样品中的苯并（a）芘经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的改变。通过检测线与限制线（C线）颜色深浅比较，对样品中苯并（a）芘进行定性判定。 3 试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。 3.1 试剂 3.1.1 正己烷：色谱纯。 3.1.2 乙腈：色谱纯。 3.1.3 二甲基亚砜（DMSO）。 3.1.4 NaH2PO42H2O。 3.1.5 Na2HPO412H2O。 3.1.6 氯化钠。 3.1.7 吐温-20。 3.1.8 氢氧化钠溶液（2 mol/L）：称取80g氢氧化钠用水溶解，并定容至1L。 3.1.9 PBST溶液：称取0.2965 g NaH2PO42H2O、2.9 g Na2HPO412H2O、8.76 g氯化钠与0.55 g吐温-20用水溶解并定容至1 L。 3.2 参考物质 苯并（a）芘参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度均95%。 表1 苯并（a）芘参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量 中文名称 英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子质量 苯并（a）芘 Benzo(a)pyrene 50-32-8 C20H12 252.32 注：或等同可溯源物质。 3.3 标准溶液的配制 苯并（a）芘标准储备液（0.1mg/mL）：精密称取适量苯并（a）芘标准品（3.2），置于10 mL容量瓶中，用乙腈（3.1.2）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.1mg/mL的苯并（a）芘标准储备液；或可干脆购买苯并（a）芘标准储备液。0 5 避光保存备用，有效期1年。 3.4 材料 苯并（a）芘胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为食用油。 3.4.1金标微孔（含胶体金标记的特异性抗体）。 3.4.2 试纸条或检测卡。 4 仪器和设备 4.1 移液器：100 µL、1 mL、5 mL和10 mL。 4.2 涡旋混合器。 4.3 离心机：转速4000 r/min。 4.4 电子天平：感量为0.01 g。 4.5 氮吹仪或空气吹干仪（带温度限制）。 5 分析步骤 5.1 试样制备 取适量有代表性样品充分混匀。 5.2 试样提取和净化除脂 称取10 g油样于离心管中，加入5 mL 正己烷（3.1.1）和15 mL DMSO（3.1.3）并混合匀称。漩涡振荡2min，然后4000 r/min离心2 min。弃去上层正己烷层。加入5 mL 正己烷（3.1.1），漩涡振荡30 s，然后4000 r/min离心30 s。弃去上层正己烷层。加入10 mL 氢氧化钠溶液（2 mol/L）（3.1.8）和15 mL正己烷（3.1.1），漩涡振荡30s，然后4000 r/min离心30 s。吸取上层正己烷层于15 mL离心管，4000 r/min离心2 min。取全部正己烷层于氮吹管中，50氮吹或空气吹10 min，吹干后加入200L DMSO（3.1.3）复溶，混合匀称，此为待测液。 5.3 测定步骤 打开试纸筒，取出所需数量的红色反应微孔（取出微孔后，马上盖好桶盖，以防受潮）。往微孔中加入200 L的PBST溶液，再加入50 L待测液，上下抽吸510次至微孔试剂混合匀称，室温（2025）反应7 min。将已做好标记的试纸条插入至上述红色微孔中，使样品垫充分进 入样品中，并计时7 min。从微孔中取出试纸条，弃去试纸条下端的样品垫，进行结果判定。 5.4 质控试验 每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。 5.4.1 空白试验 称取空白试样，根据5.2和5.3步骤与样品同法操作。 5.4.2 加标质控试验 精确称取空白试样（精确至0.01 g）置于玻璃试剂瓶中，加入肯定体积的苯并（a）芘标准储备液（0.1 mg/mL）（3.3.1），使试样中苯并（a）芘浓度为10 g/kg，根据5.2和5.3步骤与样品同法操作。 6 结果判定方式 由于长时间放置会引起质控线（C线）与检测线（T线）颜色的改变，需在规定时间内进行结果判定。试纸条与检测卡如图1所示。结果判定也可依据产品说明书进行。 6.1 读数仪测定结果 通过读数仪对结果进行判读，依据不同厂家仪器规定进行判读。 无效：质控线（C线）不显色，无论检测线（T线）是否显色，均表示试验结果无效。 阳性：若检测结果显示“+”（阳性），表示试样中含有待测组分且其含量大于等于方法检出限。 阴性：若检测结果显示“-”（阴性），表示试样中不含待测组分或其含量低于方法检出限。 6.2 目视判定 通过对比质控线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。 无效：质控线（C线）不显色，无论检测线（T线）是否显色，均表示试验结果无效。 阳性：质控线（C线）显色，若检测线（T线）不出现或出现但颜色浅于质控线（C线），表示试样中含有待测组分且其含量高于方法检出限，判为阳性。 阴性：质控线（C线）显色，若检测线（T线）颜色深于或等于质控线（C线），表示试样中不含待测组分或其含量低于方法检出限，判为阴性。 6.3 质控试验要求 空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。 C T S C S T C T S C T S C T S C T S 加样孔 无效 阴性 阳性 B检测卡 吸水纸 NC膜 样品垫 无效 阴性 阳性 C线 T线 A试纸条 图1目视判定示意图 7 结论 当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。 8 性能指标 8.1 检测限 10g/kg。 8.2 灵敏度 95%。 8.3 特异性 85%。 8.4 假阴性率 5%。 8.5 假阳性率 15%。 注：性能指标计算方法参见附录A。 9 其他 本方法分析步骤和结果判定可以依据厂家试剂盒的说明书进行，但应符合或优于本方法规定的性能指标。 本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法运用者供应便利，在运用本方法时不做限定。方法运用者在运用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满意本方法规定的各项性能指标。 本方法参比标准为GB 5009.27-2016食品平安国家标准 食品中苯并（a）芘的测定。 本方法运用试剂盒可能与苯并（a）蒽、苯并（b）荧蒽、苯并（e）芘、苯并（j）荧蒽等物质存在交叉反应，当结果判定为阳性时应对结果进行确证。 附录A 定性方法性能计算表 表A.1性能指标计算方法 样品状况a 检测结果b 总数 阳性 阴性 阳性 N11 N12 N1.=N11+N12 阴性 N21 N22 N2.=N21+N22 总数 N.1=N11+N21 N.2=N12+N22 N=N1.+N2.或N.1+N.2 显著性差异（2） 2=（|N12-N21|-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1 灵敏度（p+，%） p+=N11/N1. 特异性（p-，%） p-=N22/N2. 假阴性率（pf-，%） pf-=N12/N1.=100-灵敏度 假阳性率（pf+，%） pf+=N21/N2.=100-特异性 相对精确度，%c （N11+N22）/(N1.+N2.) 注： a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果。 b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算运用确认后的结果。 N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，其次个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示全部的第一行，N.2表示全部的其次列；N12表示第一行，其次列。 C为方法的检测结果相对精确性的结果，与一样性分析和浓度检测趋势状况综合评价。 本方法负责起草单位：广东省食品检验所。 验证单位：成都市食品药品检验探讨院、中国农业科学院油料作物探讨所。 本方法主要起草人：熊含鸿、王立亚、简德威、陈思敏、雷毅