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-_高中生物选修一生物技术实践 知识点总结专题一 传统发酵技术的应用课题一 果酒和果醋的制作1、发酵：通过微生物技术的培养来生产大量代谢产物的过程。2、有氧发酵：醋酸发酵 谷氨酸发酵 ·无氧发酵：酒精发酵 乳酸发酵 3、酵母菌是兼性厌氧菌型微生物真菌 ·酵母菌的生殖方式：出芽生殖(主要) 分裂生殖 孢子生殖4、在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖。反应式： 5、在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。 反应式： 6、 左右最适宜酵母菌繁殖 酒精发酵时一般将温度控制在 7、在葡萄酒自然发酵的过程中,起主要作用的是附着在葡萄皮表面的 .在发酵过程中,随着酒精浓度的提高,红葡萄皮的色素也进入发酵液,使葡萄酒呈现深红色.在 呈 性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。8、醋酸菌是单细胞细菌(原核生物),代谢类型是 型,生殖方式为二分裂9、当 、 都充足时，醋酸菌将 分解成醋酸；当缺少 时，醋酸菌将 变为 ，再将 变为醋酸。反应式： 10、控制发酵条件的作用醋酸菌对 的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。醋酸菌最适生长温度为 ，控制好发酵温度，使发酵时间缩短，又减少杂菌污染的机会。有两条途径生成醋酸：直接氧化和以酒精为底物的氧化。11、实验流程：挑选葡萄冲洗榨汁酒精发酵果酒（醋酸发酵果醋）12、酒精检验：果汁发酵后是否有酒精产生，可以用 来检验。在酸性条件下，与酒精反应呈现 色。先在试管中加入发酵液 2L，再滴入物质的量浓度为 3mol/L 的 H2SO43 滴，振荡混匀，最后滴加常温下饱和的 溶液 3滴，振荡试管，观察颜色13、充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出二氧化碳的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身相连接，其目的是防止 。开口向下的目的是有利于 的排出。使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制 时，应该充气口连接气泵，输入 。-_疑难解答（1）你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。（2）你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？如：要先冲洗葡萄，再除去枝梗；榨汁机、发酵装置要清洗干净，并进行酒精消毒；每次排气时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖等。（3）制葡萄酒时，为什么要将温度控制在 1825？制葡萄醋时，为什么要将温度控制在 3035？温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。20左右最适合酵母菌的繁殖。因此需要将温度控制在其最适温度范围内。而醋酸菌是嗜温菌，最适生长温度为 3035，因此要将温度控制在 3035。专题二 微生物的培养与应用课题一 微生物的实验室培养·培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。·培养基按照物理性质可分为液体培养基 半固体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂）后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。·培养基的化学成分包括 、 、 、 、生长因子等。·碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如 CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。·氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如 N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用 N2。·培养基还要满足微生物生长对 pH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养 时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的 pH 调至 ，培养 是需要将 pH 调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供 的条件·无菌技术·获得纯净培养物的关键是防止 的入侵，要注意以下几个方面：对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行 。将用于微生物培养的器皿、 和 等器具进行灭菌。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在 附近进行。实验操作时应避免 处理的材料用具与周围的物品相接触。无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。-_·消毒与灭菌的区别消毒指使用较为温和的 方法仅杀死物体表面或内部的 微生物（不包括芽孢和孢子） 。消毒方法常用 ， （对于一些不耐高温的液体）还有 （如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、 消毒。灭菌则是指使用强烈的 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有 灭菌、 灭菌、 灭菌。灭菌方法：接种环、接种针、试管口等使用 灭菌法；玻璃器皿、金属用具等使用 灭菌法，所用器械是 灭菌箱 ；培养基、无菌水等使用 灭菌法，所用器械是 灭菌锅 。表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯 。比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒较为温和部分生活状态的微生物不能灭菌强烈全部微生物能制作牛肉膏蛋白胨固体培养基（1）方法步骤： 、称量、溶化、 、 。（2）倒平板操作的步骤：将灭过菌的培养皿放在 旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约 1020mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。等待平板冷却凝固，大约需 510min。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。·倒平板操作的讨论1.培养基灭菌后，需要冷却到 50左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造-_成污染。4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。纯化大肠杆菌（1）微生物接种的方法最常用的是 法和 法。（2） 法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将 的菌种 分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子 ，这就是 。（3） 法是将菌液进行一系列的 ，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列 操作和 操作两步。（4）用 法和 法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于 菌种。（5）平板划线法操作步骤：将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。将试管口通过火焰。将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。将试管通过火焰，并塞上棉塞。左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划 条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将 的划线与 相连。将平板倒置放入培养箱中培养。·平板划线操作的讨论1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？-_答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。（6）涂布平板操作的步骤：将涂布器浸在盛有 的烧杯中。取少量菌液，滴加到培养基表面。将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却 810s。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布平板操作的讨论涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第 2 步应如何进行无菌操作？提示：应从操作的各个细节保证“无菌” 。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。菌种的保存（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。临时保藏方法将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入 的冰箱中保藏。以后每 36 个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。缺点：这种方法保存的时间 ，菌种容易 。（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。在 3mL 的甘油瓶中，装入 1mL 甘油后灭菌。将 1mL 培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在 的冷冻箱中保存。课题二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数尿素 是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶尿素最初是从人的尿液中发现的筛选菌株（1）实验室中微生物的筛选应用的原理人为提供有利于 生长的条件（包括 、 、 等） ，同时 其他微生物生长。（2）选择性培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作 。（3）配制选择培养基的依据-_根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。统计菌落数目（1）测定微生物数量的常用方法有 和 。（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置 35 个平板，选择菌落数在 30300 的平板进行计数，并 。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。采用此方法的注意事项：1.一般选取菌落数在 30300 之间的平板进行计数 2.为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入 TTC 3.本法仅限于形成菌落的微生物设置对照设置对照的主要目的是排除 对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。实验设计实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。（1）土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH7 的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约 38cm 的土壤层取样。（2）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在 之间、适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量，一般选用 104 105 106测定放线菌的数量，一般选用 103 104 105测定真菌的数量，一般选用 102 103 104（3）微生物的培养与观察不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌 3037 12 天放线菌 2528 57 天 霉菌 2528 34 天每隔 24 小时统计一次菌落数目，选取菌落数目 的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致一楼菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、唯独及培养时间） ，同种微生物表现出稳定的菌落特征。形状、大小、隆起程度、颜色-_疑难解答（1）如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计 3 个平板，计算出平板菌落数的平均值每克样品中的菌落数=（C/V）*M 其中，C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V 代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml） ，M 代表稀释倍数在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的 将尿素分解成了 。使培养基的 增强，PH 。在以尿素为唯一 的培养基中加入 指示剂，培养某种细菌后，如果 PH ，指示剂将变 。专题三 植物的组织培养技术 课题一 菊花的组织培养植物组织培养的基本过程细胞分化：在生物个体发育过程中，细胞在形态、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程。离体的植物组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织，愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的 ，或者叫做去分化。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做 。再分化形成的试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物体。·细胞分化是一种持久性的变化，它有什么生理意义？使多细胞生物体中细胞结构和功能趋向专门化，有利于提高各种生理功能的效率。比较根尖分生组织和愈伤组织的异同影响植物组织培养的条件材料：不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。植物材料的选择直接关系到试验的成败。植物的种类、材料的 和 的长短等都会影响实验结果。菊花组织培养一般选择 的茎上部新萌生的侧枝作材料。一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。选取生长旺盛嫩枝进行组培的是嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。营养：离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。常用的培养基是 培养基，其中含有的大量元素是 ，微量元组织类型细胞来源细胞形态细胞结构细胞排列细胞去向 根尖 分生组织受精卵正方形无液泡紧密分化成多种 细胞组织 愈伤组织高度分化细胞无定形高度液泡化疏松再分化成新个体 相同点都通过有丝分裂进行细胞增殖-_素是 ，有机物有 、烟酸、肌醇、维生素、 等。激素：植物激素中 和 是启动细胞分裂、 和 的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势。在培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物激素，其浓度、使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。环境条件：PH、温度、光等环境条件。 不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将 pH 控制在 左右，温度控制在 ，并且每日用日光灯照射 h. 4、操作流程配制 MS 固体培养基：配制各种母液：将各种成分按配方比例配制成的浓缩液（培养基母液）。·使用时根据母液的浓缩倍数，计算用量，并加蒸馏水稀释。·配制培养基：应加入的物质有琼脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，并用蒸馏水定容到 1000 毫升。·在菊花组织培养中，可以不添加植物激素原因是菊花茎段组织培养比较容易。·灭菌：采取的灭菌方法是 。·MS 培养基中各种营养物质的作用是什么？与肉汤培养基相比，MS 培养基有哪些特点？大量元素和微量元素提供植物细胞所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，维持细胞渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营养为主，MS 培养基则需提供大量无机营养。外植体的消毒 外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段。选取菊花茎段时，要取 。菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流使用顺序实验结果先生长素，后细胞分裂素有利于分裂但不分化先细胞分裂素，后生长素细胞既分裂也分化同时使用 提高生长素 细胞分裂素比值与结果比值高时促根分化，抑芽形成比值低时促芽分化，抑根形成比值适中促进 生长-_水下冲洗 20min 左右。用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为 的酒精中摇动 23 次，持续 67s，立即将外植体取出，在 中清洗。取出后仍用无菌吸水纸吸干外植体表面水分，放入质量分数为 0.1%的 溶液中 12min。取出后，在无菌水中至少清洗 3 次，漂洗消毒液。注意：对外植体进行表面消毒时，就要考虑药剂的消毒效果，又要考虑植物的耐受能力。接种：接种过程中插入外植体时形态学上端朝上，每个锥形瓶接种 78 个外植体。外植体接种与细菌接种相似，操作步骤相同，而且都要求 操作。培养：应该放在 中进行，并定期进行 ，保持适宜的温度（ ）和光照（ h）移栽：栽前应先打开培养瓶的封口膜，让其在培养间生长几日，然后用流水清洗根部培养基。然后将幼苗移植到消过毒的 等环境中生活一段时间，进行壮苗。最后进行露天栽培。栽培 将幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。专题 4 酶的研究与应用课题 1 果胶酶在果汁生产中的作用一、果胶与果胶酶的作用 1.果胶 是植物 及 的主要组成成分之一，由 聚合而成的一种高分 子化合物，不溶于 。 2果胶酶 （1）果胶酶的作用是分解 变成可溶性的 。 （2）果胶酶不是特指某一种酶，而是分解 的一类酶的总称，包括 酶、酶和 酶等；果胶酶的化学本质是蛋白质，也能被蛋白酶水解掉； （3）胶酶具有酶的通性：只改变反应 ，不改变反应的平衡点。二、酶的活性与影响酶活性的因素 1酶的活性是指酶 一定化学反应的能力，其高低用一定条件下酶所催化的某 一化学反应的 来表示。酶反应速度用 内， 中反应物的 或产物的 表示。 2影响酶活性的因素常提的是 、 和酶的抑制剂等。 3. 探究温度和 pH 对酶活性的影响及探究果胶酶用量的两个实验都要注意实验的基本原则：原则和 原则，理解实验中温度梯度或 pH 梯度的变化在分析问题时也要用原则分析。 三、果胶酶的用量 生产果胶时为了使果胶酶得到充分利用，控制好酶的用量，用量多少常通过 手段探究。 四、实验设计 1.探究温度和 PH 对果胶酶活性的影响-_（1）实验六成热那个包括 、设置具有一系列梯度的 和 、加入果 胶酶反应一段时间、 。 （2）该实验的自变量事 或 ，因变量是 ，检测因变量是通过测定果 汁的 或 来实现的。 思考 1：为什么在混合苹果泥和果胶酶之前，要将果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温 处理？ 提示：将果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理，可以保证底物和酶在混合时的温度 是相同的，避免了果泥和果胶酶混合时影响混合物的温度，从而影响果胶酶活性的问题。 思考 2：为什么能够通过测定滤出的苹果汁的体积大小来判断果胶酶活性的高低？ 提示：果胶酶将果胶分解为小分子物质，小分子物质可以通过滤纸，因此苹果汁的体积大 小反应了果胶酶的催化分解果胶的能力。在不同的温度和 pH 下，果胶酶的活性越大，苹果 汁的体积就越大。 2.探究果胶酶的用量 （1）该实验的自变量是 ，除此之外，影响果汁产生的因素还有 、PH、 、苹果泥等无关变量。 （2）判断的思路是：如果随着酶的用量增加，过滤到果汁的体积也增加，说明 ，如果当酶的用量增加到某个值后，再增加酶的用量，过滤到的果汁的体积不再改变，说 明 。专题五 和蛋白质技术课题 6 血红蛋白的提取和分离 一、实验原理蛋白质的物化理性质：形状、大小、 和多少、溶解度、 、 亲和力等千差万别，由此 各种蛋白质。1凝胶色谱法（ 法）：（1）原理：是根据 的大小分离蛋白质的有效方法。分子量大的分 子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程 ，流动 ；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内 部，路程 ，流动 。 （原因是由于 作用进入凝胶颗粒内部而被滞留。 ）（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。（3）分离过程： 混合物上柱 大分子流动 、小分子流动 收集 分子收集 分 子 ：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。（4）作用： 分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。2缓冲溶液（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如 H2CO3NaHCO3， NaH2PO4/Na2HPO4等） ，调节酸和盐的用量，可配制不同 pH 的缓冲液。-_（2）缓冲液作用：抵制外界 对溶液 的干扰而保持 稳定。3电泳法：（1）原理：不同蛋白质的 以及分子本身的 不同，在电场中受到 的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动 和运动 不同。（2）分离方法： 电泳、 电泳等。（3）分离过程：在一定 pH 下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的 SDS，形成“蛋白质SDS 复合物” ，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。二、实验步骤1样品处理 5、红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是 ，采集的血样要及时采用 离心分离红 细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层暗红色的 倒入 烧杯，再加入 体积的生理盐水，缓慢搅拌 min， 离心，如此重复洗 涤三次，直至 ，表明红细胞已洗涤干净。 血红蛋白的释放 在 和 作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。 注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解 ，有利于血红蛋白的释放和分离。 2粗分离 分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为 层。第一层为无色透明的 ，第 2 层为白色薄层固体，是 ，第 3 层是红色透明液体，这是 的水溶液，第 4 层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性 沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 透析 取 1mL 的血红蛋白溶液装入 中，将 放入盛有 300mL 的物质的量的 浓度为 20mmol/L 的 ，透析 12h。透析可以去除样品中 的杂质， 或用于更换样品的 。3纯化调节缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝 胶面平齐，关闭出口。加入蛋白质样品：用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱柱的顶端。加样后， 打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入凝胶层后， 关闭出口。调节缓冲液面：加入 20mmol/L 的磷酸缓冲液到适当高度洗脱：连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。收集分装蛋白质：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集。-_4.纯度鉴定-SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做） 三、注意事项 1. 电泳技术 电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大 小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、 鉴定或提纯的目的。2. 红细胞的洗涤 如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过 高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红 蛋白的提取纯度。 3如何检测凝胶色谱柱的装填是否成功 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯， 检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、 平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除 气泡，消除不了时要重新装柱。 4为什么凝胶的装填要紧密、均匀？如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入 凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。5沸水浴处理加入洗脱液的湿凝胶的目的 不但节约时间，还能除去凝胶中可能带有的微生物和排除凝胶内的空气。 6G-75 “G”代表凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75 表示凝胶得水值，即每克凝胶膨 胀时吸水 7.5g。 7装填完后，立即用洗脱液洗脱的目的：使凝胶装填紧密8加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。 9与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离的意义 哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状，没有 。其含 有的 是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应 该收集脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 10如何检测血红蛋白的分离是否成功 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色 区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分 离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。专题六 植物有效成分的提取课题二 胡萝卜素的提取1、 胡萝卜素性质： 结晶，化学性质 ，不溶于 ，微溶于 ，易溶于 等有机溶剂。 2、 依据碳碳双键的数目划分为 、 三类。其中最主要的组成成分为 -胡萝卜素。作用：治疗夜盲症、幼儿生长发育不良、干皮症等疾病；常用于食品色素；使癌变细胞恢复成正常细胞。-_3、提取 胡萝卜素的方法主要有三种：从 中提取从大面积养殖的 中获得利用 的发酵生产实验步骤： ：使原料与有机溶剂充分接触，增大溶解度。 ：脱水温度太高，干燥时间太长会导致胡萝卜素分解。 ：除去萃取液中的不溶物 ：蒸发出有机溶剂、萃取剂的选择 水溶性的： 水不溶性的：石油醚、乙酸乙酯、 乙醚、苯、四氯化碳等选择：具有较高的 ，能够充分溶解胡萝卜素，并且 。、影响萃取的因素主要因素：萃取剂的 和 次要因素：原料颗粒的 、 、含水量、萃取的 等一般来说，原料颗粒 ，萃取温度 ，时间 ，需要提取的物质就能够充分溶解，萃取效果就好。萃取前，要将胡萝卜进行粉碎和干燥、胡萝卜素提取装置的设计：萃取过程应该避免明火加热，采用 ，这是因为有机溶剂都是易燃物，直接使用明火加热容易引起燃烧爆炸。为了防止加热时有机溶剂挥发，还要在加热瓶口安装 。萃取液的浓缩可直接使用 装置。在浓缩之前，还要进行 ，除去萃取液中的不溶物。鉴定：纸层析法滤纸：18×30基线：滤纸下端距底边 2处做一基线，在基线上取 A、B、C、D 四点。点样：用最细的注射器针头（毛细吸管）吸取样品进行点样。点样应该快速细致，在基线上形成直径左右的圆点，每次点样后，可用吹风机将溶剂吹干，注意保持滤纸干燥。等滤纸上的点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，至于装有深的石油醚的密封玻璃瓶中。等各种色素完全分开后，观察标准样品中位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带。乙醇和丙酮能够用于胡萝卜素的萃取吗？为什么？答：胡萝卜素可溶于乙醇和丙酮，但它们是水溶性有机溶剂，因萃取中能与水混溶而影响萃取效果，所以不用它们作萃取剂。2.在石油醚、醋酸乙酯、乙醚、苯和四氯化碳这几种有机溶剂中，哪种最适宜用来提取胡萝卜素？答：在这五种有机溶剂中，石油醚的沸点最高，在加热萃取时不易挥发，所以石油醚最适宜用作萃取剂。-_