实验三、质粒DNA的酶切.ppt

实验三、质粒DNA的限制性酶切鉴定、割胶回收与纯化（10学时）1.内切酶的作用原理 2.常用的酶切体系及作用条3.影响酶切的因素4.电泳检测5.胶回收试剂盒的操作步骤及注意事项概述没有核酸限制性内切酶的发现和应用，就没有分子生物学的兴旺发展，在基因工程和分子生物学中，没有一种酶像限制性内切酶那样举足轻重和应用广泛。限制性内切酶均来源于原核生物，它们的功能类似高等动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的入侵。核酸限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA的酶，即是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。限制性内切酶作用于磷酸二酯键，使双链DNA中两条单链上的3,5-磷酸二酯键断裂，产生的DNA片段5端为P,3端为OH,是基因工程的第一步获取目的基因所必须用的酶。限制性内切酶可分为三类:类和类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)DNA作用，且依赖于ATP的存在。类酶结合于识别位点并随机切割识别位点不远处的DNA，不产生特异片段，故在基因重组中没有应用价值。而类酶在特异识别位点上切割DNA分子，其切割位点在识别位点以外（很远的位点），对基因工程的意义不大。类酶由两种酶组成:一种就是通常指的限制性内切酶，它识别并切割某一特异的DNA的核苷酸序列，产生特异的DNA片段；另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列,使A（嘌呤）甲基化。类酶中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础，绝大多数能识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoR识别六个核苷酸序列:5-GAATTC-3)，有少数酶识别更长的序列或简并序列。类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如Sma:5-CCCGGG-3)；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端（3 突出和5 突出的单链末端）的DNA片段称粘性未端，如EcoR、Pst 切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。5GAATTC3 5 G AATTC3 3CTTAAG 5 3 CTTAA G5 Sma:5 -CCCGGG-3 5CCC GGG.3 3 -GGGCCC-5 3GGG CCC.5类限制性内切酶可分四类：1.异源同工酶：是不同来源分离得来的不同酶，它们有相同的识别序列，切割方式可以相同，也可不同。如Hpa与MspI,它们识别和切割序列相同，但MspI还可识别切割已甲基化的序列，如GG mCC。SmaI 和XmaI识别序列相同，但切割位点和方式不同，前者产生平末端，后者产生5粘性末端。2.Subset酶：识别与切割序列相互有关的酶互称Subset酶，如SmaI的6核苷酸序列中包含Hpa的4核苷酸序列。Subset酶之间可以代替使用，2个Subset酶消化的DNA片段，可以相互连接，连接后的重组DNA分子，可以被其中一种酶识别，或均不能识别。3.远距离裂解酶：识别位点与切割位点不一致，它们在某一核苷酸区域与识别序列结合，然后滑行到识别序列以外的另一个位点进行切割，一般滑行10个碱基左右。在基因工程中有一定的应用价值。4.可变酶：识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的，且其识别序列一般大于6个碱基，如Bgl识别GCC(N5)GGC 11个序列，其中5个是可变的。在适当的反应条件下（包括温度、pH、离子强度等），1小时内完全酶解1ug特定的DNA底物所需要的限制性内切酶的量，定义为1个活性单位（1U)。目前市场上的几乎所有的内切酶，均以噬菌体DNA作为底物测定其活性单位。限制性内切酶对于DNA底物的酶解是否完全与正确，直接关系到DNA连接、基因克隆分子筛选和鉴定等实验结果。而酶切体系的建立是其中的一个关键步骤，它所涉及的各种因素都必须引起足够的注意。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的灭菌吸管头,DNA要尽量纯，有一定的纯度。DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性：1、DNA纯度，在DNA样品中若含有蛋白质，或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高浓度金属离子，均会降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。2、核酸内切限制酶的缓冲液，核酸内切限制酶的标准缓冲液包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCL、巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等。使用所有限制酶均有可发挥活性的一种缓冲液。不同限制性内切酶对NaCl浓度的要求不同，这是不同限制酶缓冲液组成上的一个主要的不同。据此可分为高盐、中盐和低盐缓冲液。在进行双酶解或多酶解时，若这些酶切割可在同种缓冲液中作用良好，则几种酶可同时酶切；若这些酶所要求的缓冲液有所不同，可采用以下两种方法进行消化反应：先用要求低盐缓冲液的限制性内切酶消化DNA，然后补足适量的NaCl，再用要求高盐缓冲液的限制酶消化；先用一种酶进行酶解，然后用乙醇沉淀酶解产物，再重悬于另一缓冲液中进行第二次酶解。3、酶切消化反应的温度，DNA消化反应的温度，是影响限制内切酶活性的一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有各自的最适反应温度。多数限制内切酶的最适反应温度是37，少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37。4、DNA的分子结构，DNA分子构型对核酸内切限制酶的活性有很大影响，如消化超螺旋的DNA比消化线性DNA用酶量要高出许多倍。有些限制酶在消化它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率也有明显差异，这种现象称内切酶的底物位点优势效应。缓冲液缓冲液 NaCl TrisHCl(pH7.5)MgCl2 DTT低离子强度低离子强度 010 mmolL 10 mmolL 10 mmolL 1 mmolL中离子强度中离子强度 50 mmolL 10 mmolL 10 mmolL 1 mmolL高离子强度高离子强度 100 mmolL 50 mmolL 10 mmolL 1 mmolL各种缓冲液配方各种酶对不同缓冲液的相对活性单酶切或双酶切缓冲液的选择表 各种限制酶识别序列及甲基化影响注：R=G,A;Y=C,T;M=A,C;K=G,T;S=G,C;W=A,T;H=A,C T;B=G,T,C;V=G,C,A;D=G,A,T;N=A,C,G,TPromega公司酶切缓冲液的选取表限制性内切酶反应的终止 通常有以下三种方法：1、采用65条件下温浴20min，通过加热失活内切酶；2、加终止反应液（如0.5 mol/L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10 mmol/L）螯合内切酶的辅助因子Mg2+使内切酶变性以终止反应；3、通过电泳割胶回收或用酚/氯仿抽提，然后乙醇沉淀，此法最为有效且有利于下一步的DNA的操作。酶切完成后，不必立即进行终止反应，可先取出适量反应液进行快速的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察酶切结果，再决定是否终止反应。在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1g。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37)。对质粒DNA酶切反应而言,限制性内切酶用量可按标准体系1 g DNA加1单位酶，消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-5倍，反应时间也要适当延长，但过分加大酶量，甘油会影响反应外，酶本身会导致识别序列的特异性下降,产生酶的星号活力。限制性内切酶的星号活力：限制性内切酶在非标准的反应条件下，能切割一些与其识别序列类似的序列，这种现象称星号活力。每一种酶在特别的条件下均会产生这种活力。星号活力的识别形式常对标准识别序列中两侧的碱基没有特异性，如EcoR在高pH或低盐离子强度下，其识别序列由G AATTC变为N AATTN，另一种情况是对AATT中的A、T分辨不严格。产生星号活力的原因：高甘油含量、酶量过大、低离子强度、高pH（8.0）、含有有机溶剂、非Mg2+的二价离子存在。一、设备75的恒温水浴箱、核酸电泳仪和电泳槽、紫外扫描分析仪、紫外凝胶成像仪、台式高速离心机、微波炉、移液器、ependdorf管及离心管架等。二、材料1DNA底物DNA或重组质粒DNA或制备的植物组织DNA。2限制性内切酶及其缓冲液购自TAKARA公司，在配套的缓冲液中该限制性内切酶均可获得100%酶切活性。3.灭菌的离心管和移液器Tip头三、试剂15TBE电泳缓冲液：称取 Tris 54 g，硼酸27.5 g，并加入 0.5M EDTA(pH8.0)20ml，定溶至1000 ml。0.5TAE为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。2溴酚蓝指示剂溶液(6上样缓冲液)称取溴酚蓝100 mg，加双蒸水5 ml，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25 g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至50 ml，加入NaOH 1滴，调至蓝色。3溴化乙锭(EB，1 mg/ml)戴手套谨慎称取EB 20 mg于棕色试剂瓶中，加20ml双蒸水，溶解后贮于4备用，配制琼脂糖凝胶时每100 ml凝胶加50 l EB。4DNA分子量标准根据需要购买，一般浓度为0.5 g/l。操作步骤：（一）酶切反应1 酶切混合液配制：将缓冲液5 l、重组质粒DNA(5g,30 ul)、限制性内切酶5-10U（1ul）加至0.5ml Eppendorf管中，加双蒸水至50 l，加盖，混匀后稍离心；2.37水浴箱中反应1-2h；3.终止酶反应：可根据需要采用不同的方法。酶切后不需进行下一步反应，可加入含EDTA的终止液终止反应；若需进一步反应(如连接，切割等)，可将反应管置65保温20-30分钟，以灭活酶终止反应；可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀获得较纯DNA或割胶回收DNA进行下一步酶学操作。（二）酶切产物的电泳分离和鉴定1、稀释缓冲液的制备：取5TBE缓冲液 5 ml加水至50 ml，配制成0.5TBE稀释缓冲液。2、胶板的制备：将冷却至60左右的琼脂糖凝胶液，缓慢倒入内槽，直至所需厚度，注意不要形成气泡，特别是梳子下，如有气泡可用牙签挑破。待胶凝固后，小心取出梳子，将带凝胶的内槽放入电泳槽中，凝胶点样端靠近负极。3、加入1TAE缓冲液至电泳槽中，使缓冲液淹过凝胶表面0.5 CM。4、加样：剪取适当大小的蜡膜(Parafilm膜)，取6上样缓冲液1 l点于膜上数点。取5 l酶切DNA样品、0.5-1 g未酶切质粒DNA、DNA分子量标准分别与上样缓冲液混匀，将其分别加入凝胶点样孔，记录点样顺序及点样量。5、电泳：接通电源槽与电泳仪的电源(点样端接负极，另一端接正极)，调好电压(5 V/cm凝胶长度)，开始电泳。当溴酚蓝染料移动至凝胶前沿约1 cm处，切断电源，停止电泳。6、观察结果：取出内槽，将凝胶小心推入紫外扫描分析仪的玻璃平板上，关上仪器防护屏，在计算机上观察并扫描记录质粒DNA与酶切DNA电泳结果，比较分析经酶切与未经酶切的DNA图谱的区别。注意事项：1酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。2进行DNA酶切时，要在其最适温度下(大多数为37)进行，最好使用每一种酶的专用缓冲液。当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割，如遇双酶酶切，应先用低盐缓冲液后用高盐缓冲液，或一种酶切结束后加TE至400l，再进行酚/氯仿抽提、乙醇沉淀，重新建立第二个酶切反应体系。3限制性内切酶一定要低温下贮存(20)，以防止酶活性降低。4进行大量酶切时，先要确定限制性内切酶的浓度。一般1U 限制性内切酶于37条件下作用底物DNA 1h以上可切割1g DNA。一般来说，要用2-3倍才能保证完全消化，对基因组DNA尤其如此。市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。5琼脂糖凝胶的浓度直接影响DNA片段的分离效果，一定要根据被分离DNA片段的大小确定好合适的琼脂糖凝胶浓度。6EB是DNA的诱变剂具极强的致癌性，配制和使用过程中要特别小心，操作时要戴手套，有EB的废液和器皿要分别处理好。7大多数限制酶贮存在50甘油溶液中，以避免在-20条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于10时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。8浓缩的限制酶可在使用前用1限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶失活，用水稀释的酶不能长期保存。9反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4 g/l。10酶切反应所加入的酶量应适中，根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定，对不同的限制酶，各厂家均有一最大的消化量指标可参考。11反应混合液中加入浓度为0.1 mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。12酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醚，大于10 mM的EDTA，去污剂SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。13DNA碱基上的甲基化修饰也是影响酶切的一个重要因素，所以转化实验所选择的受体菌株应考虑到使用的菌株中的酶修饰系统。14要保证酶作用时的最佳反应条件(pH,温度)和底物用量，酶反应才能有效地进行。15反应取酶时必须使用新的无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间，从冰箱中取出后，应置于冰上。16高于37或需长时间保温时，可加入矿物油覆盖在反应液上以减少水分蒸发。17.反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。18分子克隆是微量操作技术，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。19不同厂家的试剂不可混用，需要时请查明相关条件及数据。20要注意酶切时加样的次序，一般次序为水、缓冲液、DNA各项试剂，最后才加酶液。取液时，Tip头要从溶液表面吸取，以防止Tip头沾去过多的液体与酶，待用的内切酶要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回-20冰箱，防止限制性内切酶的失活。DNA片段的纯化回收实际应用：纯化回收DNA酶切片段纯化回收PCR扩增产物纯化回收标记的DNA探针实验目的：1.理解并掌握DNA片段纯化回收的原理和步骤2.熟练操作DNA割胶回收的过程原理：本试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中回收多至8ug DNA(70bp-10kb),回收率为60-85%。琼脂糖凝胶在温和缓冲液（DE-A溶液）中溶解，其中的保护剂能防止线状DNA在高温下降解，然后在DE-B溶液的作用下使DNA选择性结合到膜上，经W1、W2溶液的洗涤清除蛋白和盐分，最后有pH洗脱液从膜上洗脱下来。纯化的DNA可直接用于连接、体外转录、PCR扩增、测序、微注射等分子生物学实验。试剂Buffer DE-A：凝胶熔化剂，含DNA保护剂，防止DAN在高温下降解。一定温度下(75)，使琼脂糖凝胶融化。Buffer DE-B：结合液：是一种高盐、低PH值的溶液,作用是使大于70bp的DNA片段选择性结合到吸附柱上的DNA制备膜上。异丙醇:使DNA分子更好的拦截在膜上，所以回收小于400bp的片段时，能提高回收效率Buffer W1：洗涤液，将蛋白质等杂质去除。Buffer W2：用前加入等体积的无水乙醇混合均匀，成分：一般是含50乙醇（V/V）的TE。作用：将盐份被完全清除，消除下游操作酶的影响。Eluent：洗脱缓冲液，低盐浓度，高pH值。一般用2.5mM Tris-Cl（pH8.5），作用：将DNA从硅基质中洗脱 实验三的流程质粒的提取酶切制胶，进行琼脂糖凝胶电泳切胶，DNA回收电泳验证回收效率胶回收流程切胶 加入DE-A胶溶解 加入DE-B和异丙醇（提高回收率）混匀 加入吸附柱中 DNA结合到柱上 加入洗涤液W1（除杂质）离心 加入洗涤液W2（除杂质）离心 加入洗涤液W2（除杂质）离心 加入洗脱缓冲液 离心洗脱纯净DNA（三）酶切产物的割胶回收酶切产物的割胶回收用AxyGEN割胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段，步骤如下：1、在紫外灯下用一锋利刀片从凝胶中割取目的片段带，测定重量（mg）；2、加入3倍胶体积(mg/l)的Buffer DE-A缓冲液；3、悬浮均匀后于75加热，每隔2-3 min混合一次，直至凝胶块完全融化（约6-8 min）；4、按Buffer DE-A体积的50加入Buffer DE-B，混合均匀。当回收的DNA片段小于400 bp时，加入1倍胶体积的异丙醇，混匀；5、将以上样品转至DNA-prep Tube离心柱，离心柱置于2 ml收集管上，12000 rpm离心1 min，弃滤液；6、用500 l Buffer W1洗柱，12000 rpm离心1 min，弃滤液；7、用700 l已加无水乙醇的Buffer W2洗柱，12000 rpm离心1 min，弃滤液，用同样的方法再用700 l Buffer W2洗涤一次；8、将DNA-prep Tube置于1.5 ml离心管中，12000 rpm离心1 min，以彻底去除Buffer W2；9、将DNA-prep Tube置于另一洁净的1.5 ml离心管中，在silica膜中央加25-30 l Eluent以溶解柱中DNA，室温静置1 min，12000 rpm离心1 min，收集离心液即为DNA溶液。注意事项注意事项:1.在步骤1中，将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶融化时间（线性DNA长时间暴露在高温条件下易水解），从而提高回收率。勿将含DNA的凝胶长时间地暴露在紫外灯下，减少紫外线对DNA造成的损伤。2.步骤2中凝胶必须完全熔化，否则严重影响DNA回收率。3.Eluent或去离子水加热至65，有利于提高洗脱效率。4.DNA分子呈酸性，建议在2.5 mM Tris-HCl，pH8.5洗脱液中保存,减少DNA的脱氨反应。5.尽量切除不含DNA的凝胶。得到凝胶体积越小越好，不然影响回收率。6.回收纯化的DNA 片段一般在100bp到50kb之间，过长，过短片段的回收效率迅速降低。7.使用前，Buffer W1中加入等体积的无水乙醇