克隆载体表达载体(课件).ppt

LOGO克隆载体克隆载体 表达载体表达载体 定义：定义：可携带插入的外源外源DNA片段片段并可转入受体细胞中大量扩增大量扩增的DNA分子。该分子中含有能够在受体细胞中自主复制的序列和筛自主复制的序列和筛选标记选标记，常用于外源基因的克隆，如噬菌体或质粒。通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体注意不能破坏载体的自我复制性质的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。克隆载体克隆载体克隆载体必须具备什么条件克隆载体必须具备什么条件?具有使外源具有使外源DNA片段插入片段插入的限制性酶识的限制性酶识别位点（外源别位点（外源性性DNA能组入）能组入）能将外源能将外源DNA导入到受体细导入到受体细胞并进行自我胞并进行自我复制（能繁殖）复制（能繁殖）必须具有选择必须具有选择标记（能筛选标记（能筛选出来）出来）A C B 常用的克隆载体常用的克隆载体 质粒载体质粒载体 病毒载体病毒载体(噬菌体载体噬菌体载体)混合载体（由以上三类中的两种以上相混合载体（由以上三类中的两种以上相互组合或与其他基因组互组合或与其他基因组DNADNA组合而成）组合而成）高质量的克隆载体所必须具备的一些特征：高质量的克隆载体所必须具备的一些特征：拷贝数不能太低，以保证转化效率应该有两个以上用来克隆外源DNA的单一的限制性内切酶识别位点；应该有一个或多个易于检出的选择标记基因123专用载体专用载体 染色体定位整合载体染色体定位整合载体 启动子探针载体启动子探针载体 诱导型表达载体诱导型表达载体 组织特异性表达载体组织特异性表达载体 反义表达载体反义表达载体 v 定义：定义：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达目的基因能够表达的载体。v 包括原核表达载体原核表达载体和真核表达载体真核表达载体，可以是质粒、噬菌体或病毒等。典型的表达载体带有能使基因表达的调控序列调控序列，并在适当位置有可插入外源基因的限制性内限制性内切酶位点切酶位点。表达载体表达载体LOGO常用细菌质粒进行构建，构建过程中运常用细菌质粒进行构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端（多为黏性末端，也有平末相合的末端（多为黏性末端，也有平末端），采用端），采用DNA连接酶连接，导入生物连接酶连接，导入生物体实现表达。标记基因可帮助识别质粒体实现表达。标记基因可帮助识别质粒并检测是否成功整合到染色体并检测是否成功整合到染色体DNA中。中。表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因 表达载体必须具备的条件：表达载体必须具备的条件：1.载体能够独立的复制；2.应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选；3.应具有很强的启动子，能被RNA聚合酶所识别；4.应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录；5.应具有很强的终止子，以使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，同时使很强的终止子所产生的mRNA较为稳定；6.所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，以便转录后能顺利翻译。LOGO