real-time PCR.pptx

荧光实时荧光实时定量定量PCRReal-timePCR报告人：余祥单报告人：余祥单目录目录A.A.定义定义B.B.B.B.化学原理化学原理化学原理化学原理C.C.C.C.数学数学数学数学原理原理原理原理D.D.荧光定量荧光定量PCR如何减小如何减小误差误差E.E.E.E.引物设计要求引物设计要求引物设计要求引物设计要求F.F.F.F.实验流程实验流程实验流程实验流程G.G.G.G.基因拷贝数计算基因拷贝数计算基因拷贝数计算基因拷贝数计算过程过程过程过程H.H.H.H.定量定量定量定量PCRPCR仪主机的维护仪主机的维护仪主机的维护仪主机的维护 I.I.I.I.问题及解决办法问题及解决办法问题及解决办法问题及解决办法A.定义定义实时突光定量PCR(Real-timePCR)：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行 实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。B.如何知道基因数目的增加？如何知道基因数目的增加？荧光信号与基因拷贝数成正比TaqMan探针法探针法每扩增一条每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光TaqMan探针探针优缺点优缺点优点：优点：1、对对目标序列的高特异性目标序列的高特异性2、设计设计相对简单相对简单3、重复性重复性比较好比较好缺点：缺点：1、只只适合一个特定的适合一个特定的目标目标2、需、需委托委托公司标记，价格公司标记，价格较高较高3、不易不易找到本底低的探针找到本底低的探针SYBRGreenSYBRGreen能结合到双链能结合到双链DNA的小沟的小沟部位部位只有只有和双链和双链DNA结合后才结合后才发发出出荧光荧光DNA双链双链分开分开就不发出就不发出荧光荧光SYBRGreen优点优点及及缺点缺点优点优点：1、对对DNA模板没有模板没有选择性选择性，适用于任何适用于任何DNA2、使用方便使用方便，不必不必设计复杂设计复杂探针探针3、非常灵敏非常灵敏；便宜便宜。缺点缺点：1、对、对 PCR有有一定的一定的抑制作用抑制作用2、容易容易与非特异性双链与非特异性双链DNA结合，结合，产产生生假假阳性阳性（可通过溶解曲线判断非特异性扩增）溶解曲线C.定量定量原理原理：理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+E)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量E：扩增效率取对数：logX=n(1+E)+logX0logX=n(1+E)+logX0标准曲线标准曲线绝对绝对定量定量D.荧光定量荧光定量PCR如何减小误差如何减小误差1、校准生物学误差：内参(管家基因)2、校准物理误差：参比荧光 3、降低随机误差 1、校准、校准生物学误差内参生物学误差内参(管家基因管家基因)内参基因(EndogenousControl)用于校准实验过程中样品本身对定量结果的影响 原因：核酸提取时通常以重量，体积或细胞数为单位取 样，提取过程中存在得率差异和操作误差，造成等量样品不一定获得等量提取物 目的：将定量结果校准为以基因组（或单个细胞）为 单位，不同样品之间才具有可比性 校准方法：目的基因/内参=均一化的目的基因表达量 MasterMix中中ROX浓度固定浓度固定 ROX不参与不参与PCR扩增，信号强度只与扩增，信号强度只与MasterMix用量有关用量有关 ROX的功能：校准物理误差的功能：校准物理误差 耗材质量、管盖厚度、透光性能耗材质量、管盖厚度、透光性能 反应体系监控：蒸发、操作反应体系监控：蒸发、操作 2、校准、校准物理误差：参比物理误差：参比荧光荧光3、降低、降低随机误差随机误差:重复实验重复实验 生物学重复：样品三次重复 技术重复：每个样品做3-4个复孔 E.引物引物设计的要求：设计的要求：Tm=55-65GC=30-80%PCR扩增产物长度：在80-150bp之间 引物的退火温度要高，一般要在 60以上，15-25个碱基特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在F.整体实验过程整体实验过程1.扩增标准菌的目的片段2.连接到质粒上，转化进大肠杆菌中扩大培养3.提取质粒，计算拷贝数4.将质粒稀释至少5个梯度，作为标准品绘制标准曲线5.扩增待测样品基因片段6.标准品和待测样品一起qPCR，通过标准品绘制的标准曲线，得到待测样品中基因的拷贝数G.基因拷贝数计算过程基因拷贝数计算过程1、培养含有目的基因片段的质粒的大肠杆菌、培养含有目的基因片段的质粒的大肠杆菌2、提取质粒，测定、提取质粒，测定OD260和和OD280纯 DNA的 A260/A280比值为 1.8，纯 RNA为 2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。3、OD260可用于计算可用于计算DNA的的浓度浓度1A260吸光度值dsDNA50g/mlssDNA33g/mlssRNA40g/ml核酸核酸浓度浓度(OD260)x(dilutionfactor)x33或或40或或50=ng/l 基因基因拷贝数的计算：拷贝数的计算：mMnV MW平均分子量平均分子量（MW）MW表示表示 1dalton=1g/moldsDNA=（碱基数）（660道尔顿/碱基）ssDNA=（碱基数）（330道尔顿/碱基）ssRNA=（碱基数）（340道尔顿/碱基）copies=n=6.021023 例如：3000bp的质粒，浓度的质粒，浓度100ng/lMW=3000bpx660dalton/bp=1.98x106daltons（1g/mol=1daltons）摩尔数100ngx10-9/1.98x106copy数 摩尔数x6.02x10233x1010copies/l实验结果要求实验结果要求要求要求结果扩增效率大于结果扩增效率大于95%，可决系数，可决系数R2大于大于0.98，溶解曲线为单一峰。，溶解曲线为单一峰。H.定量定量PCR仪主机的维护仪主机的维护 使用不脱毛的布块擦拭仪器表面 注意正确的计算机和主机电源开关顺序 切勿使用有机溶剂清洁定量PCR仪 防灰除湿定期对仪器进行校准1、运行、运行背景校准背景校准 实验实验中，连续出现不正常的偏高信号，并表明可能存在荧光物质污染中，连续出现不正常的偏高信号，并表明可能存在荧光物质污染时时运行运行背景校准背景校准 清洁清洁样本块中污染的反应孔：样本块中污染的反应孔：a.用移液器吸取少量水或乙醇并滴入每个污染的反应孔中。用移液器吸取少量水或乙醇并滴入每个污染的反应孔中。b.吹打数次。吹打数次。c.将废液吸入废液杯中。将废液吸入废液杯中。如如未能有效清除污染物，重复以上步骤：未能有效清除污染物，重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次乙醇三次，去离子水三次 确认确认反应孔中的残留液体完全干燥反应孔中的残留液体完全干燥 建议每月执行一次背景校准建议每月执行一次背景校准 纯荧光（Dye）校准 纯纯荧光校准根据一系列荧荧光校准根据一系列荧光标准品收集荧光数据光标准品收集荧光数据 软件软件将不同纯荧光标准品将不同纯荧光标准品的荧光信息分析并存储到的荧光信息分析并存储到程序中程序中 建议每建议每1年半执行年半执行纯荧光校准纯荧光校准 I.实验中可能遇到的问题及解决办法实验中可能遇到的问题及解决办法1、八连管的购买问题，由于ABIsteponeplus使用的是0.1ml的管子，并且做qPCR的管子都是去Rnase和Dnase的。所以比普通的管子要贵很多。ABI原装：八连管￥1,271.00/125条 盖子￥1,634.00/300条Bioplastics：￥800/盒/125条（包括盖子和八连管）鼎国：￥560/盒（包括盖子和八连管）2、荧光吸收的设置 两步法PCR三步法PCR94 30s90 30s94 5s94 5s *60 30s50-60 15s*72 15sProgram:3min95denaturation,PCRconsistedof40cycles,includingan88stepforfluorescencequantification(30sat94,30sat57,90sat72and33sat88),followedbya7-minextensionat72.3、如何保证实验一次成功做预实验，确定标准曲线是完美的，并带一个样品，进行梯度稀释。分析结果，确定合适的稀释倍数。然后每个样品都做普通PCR，以保证每个样品都能P出来把有的样品P不出来，加BSA试试4、质粒的OD260/OD280偏高对实验是否存在影响OD260/OD280是评价DNA的纯度的，如果质粒不纯则测的OD260计算的质粒拷贝数就是不准确的。