荧光分析法.pdf

荧光分析法（荧光分析法（Fluorometry)荧光分析法（Fluorometry)概 述概 述一荧光定量分析方法荧光定量分析方法三荧光分析技术与应用荧光分析技术与应用四小 结小 结五基本原理基本原理二荧光分析法（Fluorometry)概述概述一荧光定量分析方法荧光定量分析方法三荧光分析技术与应用荧光分析技术与应用四小 结小 结五基本原理基本原理二一、概述一、概述 1、荧光（1、荧光（Fluorescence)物质吸收光子能量而被激发，然后从物质吸收光子能量而被激发，然后从激发态的最低振激发态的最低振动能级动能级回到回到基态基态时所发射出的光称为荧光。时所发射出的光称为荧光。荧光成像水溶性荧光黄一、概述一、概述 2、荧光分析法（2、荧光分析法（Fluorometry)根据物质的荧光谱线位置及其强度鉴定物质并测定物质含量的方法称为荧光分析法。根据光源不同，荧光可分为X射线荧光法（X-ray fluorometry)、原子荧光法（Atomic Fluorometry)及分子荧光法（Molecular Fluorometry).RoHS AnalyzerX射线荧光光谱仪原子荧光光度计LS45荧光分光光度计一、概述一、概述 3、分子荧光分析法与可见-紫外分光光度法和红外3、分子荧光分析法与可见-紫外分光光度法和红外光谱法的比较：光谱法的比较：吸收光谱发射光谱本质一般高选择性10-510-7g/mL10-810-10g/mL灵敏度不同点分子光谱分子光谱相同点红外和紫外可见荧光荧光分析法（Fluorometry)概述概述一基本原理基本原理二荧光定量分析方法荧光定量分析方法三荧光分析技术与应用荧光分析技术与应用四小 结小 结五二、基本原理二、基本原理 1、分子荧光光谱的产生1、分子荧光光谱的产生（1）分子能级与电子能级的多重性单重态（singlet state):总自旋S=0，两个电子自旋相反，M=2S+1=1三重态（triplet state):总自旋S=1，两个电子自旋方向平行，M=2S+1=3*a基态单重态b激发态单重态c激发态三重态二、基本原理二、基本原理改变不变自旋方向10-6（光学禁阻，几率小）1跃迁几率小大E单重态三重态单重态单重态跃迁类型跃迁类型的比较二、基本原理二、基本原理（2）荧光的产生处于激发态的分子返回到基态共有以下几种途径：02134adfbbceS2*S1*S0T1a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换；d.荧光；e.体系间跨越；f.磷光荧光和磷光产生的示意图021340213402134a.振动驰豫（a.振动驰豫（vibrationalrelexation)：从电子激发态的某一振动能级到达同一电子激发态的最低振动能级的过程为振动驰豫（如右图b所示）。特点：特点：发生在同一个激发态的电子能级上；时间约10-12秒。二、基本原理二、基本原理02134adfbbceS2*S1*S0T1a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换；d.荧光；e.体系间跨越；f.磷光荧光和磷光产生的示意图021340213402134b.内部能量转换b.内部能量转换（internal conversion)：当两个电子的能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，电子常常由高能级以非辐射跃迁方式转移至低能级，这种过程称为内部能量转换（如右图c所示）。特点：特点：两个电子的能级非常靠近以致其振动能级有重叠时内部转换易发生。10-110-13秒可完成。二、基本原理二、基本原理02134adfbbceS2*S1*S0T1a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换；d.荧光；e.体系间跨越；f.磷光荧光和磷光产生的示意图021340213402134c.外部能量转换c.外部能量转换（external conversion)：如果分子在溶液中激发，在激发总分子之间、分子与溶剂分子之间或通过与其他分子的碰撞而失去能量，常以热能的方式放出，这个过程称为外部能量转换。特点：特点：发生分子与分子的碰撞时；时间约10-910-7秒。二、基本原理二、基本原理02134adfbbceS2*S1*S0T1a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换；d.荧光；e.体系间跨越；f.磷光荧光和磷光产生的示意图021340213402134d.体系间跨越d.体系间跨越（intersystem crossing)：)：受激分子的电子在激发态发生反旋而改变多重性的过程（如右图e所示）。特点：特点：振动能级重迭时，产生体系间跨越的可能大;跨越后，荧光量子减弱,甚至会荧光熄灭;例如：S1*T1二、基本原理二、基本原理影响体系间跨越几率增大的因素：影响体系间跨越几率增大的因素：含重原子如碘、溴等的分子，体系间跨越最为常见。在溶液中存在氧分子等顺磁性物质也能增加体系间跨越的发生几率。原因：原因：高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反转的发生。二、基本原理二、基本原理02134adfbbceS2*S1*S0T1a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换；d.荧光；e.体系间跨越；f.磷光荧光和磷光产生的示意图021340213402134e.荧光e.荧光（Fluorescence)：电子)：电子由第一激发态单线态的由第一激发态单线态的最低振动能级跃迁到基最低振动能级跃迁到基态的任一振动能级而发态的任一振动能级而发射的光量子为荧光（如射的光量子为荧光（如右右图d图d所示）。所示）。特点：特点：荧光的能量小于所吸收的紫外光的能量，故发射荧光的波长比吸收的紫外光波长更长；时间约为10-910-7。二、基本原理二、基本原理02134adfbbceS2*S1*S0T1a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换；d.荧光；e.体系间跨越；f.磷光荧光和磷光产生的示意图021340213402134f.磷光f.磷光（Phosphorescence)：)：由第一电子激发态三线由第一电子激发态三线态的最低振动能级跃迁态的最低振动能级跃迁到基态单线态任一振动到基态单线态任一振动能级发射的光量子为磷能级发射的光量子为磷光（如光（如右图f右图f所示）。所示）。特点：特点：磷光能量比荧光小，波长比荧光长;发射时间长,约为10-410秒（原因是分子激发三重态的寿命较长）。二、基本原理二、基本原理（3）荧光与磷光的比较：10-410秒激发 荧光 磷光E激发E荧光E磷光E10-910-7秒激发单重态基态单重态荧光照射后发射的时间成因激发三重态基态单重态磷光二、基本原理二、基本原理（4）无辐射跃迁与光致发光a.无辐射跃迁：指处于激发态的分子或原子通过碰撞，以热能或动能的形式消耗其能量，降低到较低能级，这种能级的变化叫无辐射跃迁。最常见的无辐射跃迁有：振动迟豫、内部能量转换、外部能量转换和体系间跨越。b.光致发光：指处于激发态的分子或原子通过发射出一定波长的光，以辐射的形式回到基态，这种能级的变化叫光致发光(辐射跃迁)。最常见的两种光致发光：荧光和磷光。二、基本原理二、基本原理 2、激发光谱和发射光谱2、激发光谱和发射光谱硫酸奎宁的激发光谱(a)和发射光谱（b)（1）激发光谱（excitation spectrum)它指不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长的荧光所得的光谱。即固定发射光波长em，依次改变激发波长ex测荧光强度F，以F-激作得荧光物质的激发光谱（见右图（a)。二、基本原理二、基本原理硫酸奎宁的激发光谱(a)和发射光谱（b)又称为荧光光谱（fluorescence spectrum),即固定激发光波长ex,依（2）发射光谱（emission spectrum)次改变发射波长em测F、以F-发作图得荧光光谱（见右图（b)。二、基本原理二、基本原理（3）荧光光谱的特点（3）荧光光谱的特点a.斯托克斯位移（Stocks shift)：荧光发射波长总是大于激发光波长。原因：原因：激发态分子由于内部能量转换和振动驰豫过程而迅速到达S1*电子态的最低振动能级，从而存在着无辐射能量损失（内部能量转换和振动驰豫过程）。硫酸奎宁的激发光谱(a)和发射光谱（b)二、基本原理二、基本原理（3）荧光光谱的特点（3）荧光光谱的特点b.荧光发射光谱的形状与激发波长无关。原因：原因：荧光发射发生于第一电子激发态的最低能级，与分子激发至那一个电子能级无关（即使分子激发到高于S1*的电子态的更高振动能级，可通过内转换和振动驰豫等无辐射跃迁的形式释放能量回到第一电子激发态的最低能级）。02134adfbbceS2*S1*S0T1a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换；d.荧光；e.体系间跨越；f.磷光荧光和磷光产生的示意图021340213402134二、基本原理二、基本原理（3）荧光光谱的特点（3）荧光光谱的特点c.荧光光谱与激发光谱呈对称镜像关系。蒽的激发光谱和荧光光谱（溶剂：环己烷）S0S1*=4=3=2=1=0=4=3=2=1=0b4b3b2b1b0c0c1c2c3c4E4E3E2E1E4E3E2E1蒽的能级跃迁图二、基本原理二、基本原理（3）荧光光谱的特点（3）荧光光谱的特点c.荧光光谱与激发光谱呈对称镜像关系。a.斯托克斯位移-荧光发射波长总是大于激发光波长。b.荧光发射光谱的形状与激发波长无关。3、分子结构与荧光的关系3、分子结构与荧光的关系fttFF=0lna.荧光寿命（fluorescence life time)：指除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1/2时所需的时间，常用f表示。式中：F0，Ft为激发态时t=0和激发后时间t时的荧光强度。（1）荧光寿命和荧光效率如果以ln(F0/Ft)对t作图，直线斜率即为1/f，由此可计算出荧光寿命。二、基本原理二、基本原理b.荧光效率（fluorescence efficiency)：它又称为荧光量子产率（fluorescence quantum yield)，就是指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用f（0,1）表示。二、基本原理二、基本原理吸收激发光的光子数发射荧光的光子数=ff,max1 3、分子结构与荧光的关系3、分子结构与荧光的关系（2）分子结构对荧光效率的影响二、基本原理二、基本原理a.能发射荧光的物质必备的两个条件.分子一定要能吸收紫外光、可见光。.有较高的荧光量子效率。具有吸光结构，结构中有*，n*，而n*引起是弱吸收，有时不足以发射荧光，只有分子只能够存在共轭的*跃迁，也就是K带强吸收时，才可能有发生荧光。二、基本原理二、基本原理b.分子结构与荧光的关系.长共轭结构。苯萘蒽ex=205nmem=278nmf=0.11286nm321nm0.29356nm404nm0.36结论：当电子共轭越长，ex和em都将长移，荧光强度（荧光效率）也会增大。二、基本原理二、基本原理.分子的刚性和共平面。结论：在同样的长共轭分子中，分子的刚性和共平面性越大，荧光强度（荧光效率）也会增大，并且荧光波长产生长移。联苯f=0.2芴f=1.0SO3NaNCH3CH3SO3NaNC H3CH3a.1-二甲胺基萘-7-磺酸钠f=0.75b.1-二甲胺基萘-8-磺酸钠f=0.03主要是b由于空间位阻效应使分子发生扭曲，两个苯环不能共平面，从而使荧光大大减弱。HHHH反式强荧光顺式无荧光对于顺反异构体，顺式分子的两个基团在同一侧，由于空间位阻原因使分子不能共平面而没有荧光。二、基本原理二、基本原理.取代基的作用。.给电子基团能增加分子的电子共轭程度，使荧光效率提高，荧光波长长移。例如：-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-NR2、-CN等20280390C6H5CN苯基氰20285245C6H5OCH3苯基醚10270310C6H6苯18285365C6H5OH苯酚20310405C6H5NH2苯胺荧光相对强度荧光波长/nm分子式化合物取代基对苯荧光的影响（乙醇溶液）二、基本原理二、基本原理.取代基的作用。.吸电子基团会妨碍分子的电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。例如：-COOH、-NO2、-C=O、-NO、-SH、-NHCOCH3、-F、-Cl、-Br、-I等注意：注意：卤素取代基会随着原子序数的增加而减少荧光效率，这可能是由于重原子效应。NO2有荧光无荧光二、基本原理二、基本原理.取代基的作用。.对电子共轭体系作用较小的取代基对荧光的影响不明显。例如：-R、-SO3H、-NH3+等 4、影响荧光强度的外部因素4、影响荧光强度的外部因素二、基本原理二、基本原理a、温度 温度越高，荧光效率越小；反之，温度越低，荧光效率越大。原 因：原 因：温 度 升高，分子运动加快，磁撞几率增大,无辐射跃迁几率增大。荧光量子产率与温度的关系（A.罗丹明B的甘油溶液；B.硫酸铀酰的硫酸溶液）4、影响荧光强度的外部因素4、影响荧光强度的外部因素二、基本原理二、基本原理b、溶剂.溶剂介电常数增大，极性增大,n*的E增大,减小,减小；*的E 减小,f增大，增大。.溶剂含重原子或溶液、溶解氧（CBr4,C2H5I等），体系间跨越几率增大。使f减小，甚至熄灭。.溶剂粘度增大，f增大，F增大（若粘度小，分子碰撞增加,非辐射跃迁增加）。二、基本原理二、基本原理c.pH。NH3+NH2NH-无荧光pH13 4、影响荧光强度的外部因素4、影响荧光强度的外部因素二、基本原理二、基本原理d.荧光熄灭（fluorescence quenching)定义：荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或熄灭的现象。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂（quenching medium)。常见的熄灭剂有：常见的熄灭剂有：卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物。4、影响荧光强度的外部因素4、影响荧光强度的外部因素二、基本原理二、基本原理e.散射光的干扰 散射光（scattering light):当一束平行光照射在液体样品上，大部分光线透过溶液，小部分光线由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。瑞利光（Rayleigh scattering light):光子和物质发生弹性磁撞时，不发生能量交换，仅光子方向改变，这种散射光称为瑞利光。其波长与入射光相同。拉曼光（Raman scattering light):光子和物质发生非弹性磁撞，光子改变方向同时，与物质有能量交换，散射光波长有所改变，这种散射光为拉曼光。二、基本原理二、基本原理e.散射光的干扰如何消除散射光对荧光测定的影响？如何消除散射光对荧光测定的影响？硫酸奎宁在320nm光的激发下的荧光光谱和散射光谱硫酸奎宁在350nm光的激发下的荧光光谱和散射光谱荧光分析法（Fluorometry)概述概述一荧光定量分析方法荧光定量分析方法三基本原理基本原理二荧光分析技术与应用荧光分析技术与应用四小 结小 结五 1、荧光强度与荧光物质浓度的关系1、荧光强度与荧光物质浓度的关系()IIKF=0I0IF溶液产生荧光的光路示意图根据Beer定律：EcLII=100()()EcLEcLeIKIKF3.201101=三、荧光定量分析方法三、荧光定量分析方法当Ecl0.05时，经泰勒级数展开得：KcEcLIKF=03.2：当溶液在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系；当Ecl0.05时，荧光强度与溶液浓度之间不成线性关系。三、荧光定量分析方法三、荧光定量分析方法 2、定量分析方法2、定量分析方法（1）标准曲线法用已知量的标准物质经过和试样相同的处理之后，配成一系列标准溶液，测定这些溶液的荧光强度，以荧光强度为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线。然后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度，从标准曲线上求出试样中荧光物质的含量。三、荧光定量分析方法三、荧光定量分析方法（1）比例法取已知量的纯净荧光物质配一标液，使浓度在线性范围内，测Fs。同样条件下测试样Fx(若空白液的荧光强度调不到0%时，应扣除空白F0）。xsxsccFFFF=00ssxxcFFFFc00=三、荧光定量分析方法三、荧光定量分析方法荧光分析法（Fluorometry)概述概述一荧光定量分析方法荧光定量分析方法三荧光分析技术与应用荧光分析技术与应用四小结小结五基本原理基本原理二 1、荧光仪器简介1、荧光仪器简介四、荧光分析技术及应用四、荧光分析技术及应用（1）光电荧光计汞弧灯透镜透镜样品池样品池第一滤光片第一滤光片第二滤光片第二滤光片光电光电管管电表电表光电荧光计光路图高压Hg灯，产生线光谱365nm；低压Hg灯，产生线光谱254nm将不需要的光滤去低荧光的玻璃或石英制成，四面透光。只让发射的荧光照射到检测器上四、荧光分析技术及应用四、荧光分析技术及应用（2）光电荧光计氙灯样品池检测器荧光分光光度计光路图四、荧光分析技术及应用四、荧光分析技术及应用（3）荧光光电计与荧光分光光度计的比较光电荧光计荧光分光光度计激发光源汞灯氙灯激发单色器第一滤光片光栅发射单色器第二滤光片光栅检测器光电倍增管样品池石英、玻璃池（低荧光的玻璃）2、荧光分析新技术(自学)2、荧光分析新技术(自学)四、荧光分析技术及应用四、荧光分析技术及应用（1）时间分辨荧光分析（time-resolved fluorometry)该方法是利用分子荧光的寿命不同，可在激发和检测之间延缓一段时间，使具有不同荧光寿命的物质达到分别检测的方法。优点：该法具有对荧光体混合物中两组分同时测定、消除痕量分析中干扰物与荧光背景等优点。四、荧光分析技术及应用四、荧光分析技术及应用（2）同步荧光分析（synchromous fluorometry)指在荧光物质的激发光谱和发射光谱中选择一适宜波长差值(通常选用ex,max与em,max之差），同时扫描荧光发射波长和激发波长，得到同步荧光光谱。优点：该法具有简化光谱、窄化谱带、减少光谱的重叠现象和减少散射光的干扰等优点。()emexspFKcFFexem=,四、荧光分析技术及应用四、荧光分析技术及应用此外，随着其他科学的迅速发展，促进了相分辨荧光光谱法、低温荧光分析法、近红外荧光分析法、荧光探针技术、单分子荧光检测技术和荧光光纤化学传感器等荧光分析方面的某些新方法、新技术的发展。汞离子荧光探针在活细胞的汞信号识别近红外荧光光谱仪Nikon单分子荧光系统荧光分析法（Fluorometry)概述概述一荧光定量分析方法荧光定量分析方法三荧光分析技术与应用荧光分析技术与应用四小结小结五基本原理基本原理二 1、掌握去活化的几条途径是什么？有何区别？熟悉1、掌握去活化的几条途径是什么？有何区别？熟悉三重态、单重态概念。三重态、单重态概念。五、小结五、小结 2、掌握荧光、磷光定义,2、掌握荧光、磷光定义,成因及它们的区别。成因及它们的区别。3、3、f f概念。概念。4、激发光谱、荧光光谱定义及荧光光谱的特点。4、激发光谱、荧光光谱定义及荧光光谱的特点。5、如何找ex、em?5、如何找ex、em?6、Raman光、Reyleigh光定义及影响。6、Raman光、Reyleigh光定义及影响。7、了解分子吸收光谱与荧光光谱区别。7、了解分子吸收光谱与荧光光谱区别。五、小结五、小结 8、了解F=KC使用范围（8、了解F=KC使用范围（Ecl0.05）。Ecl0.05）。9、了解影响荧光强度的因素。9、了解影响荧光强度的因素。10、了解仪器部件、两种仪器区别。10、了解仪器部件、两种仪器区别。六、复习思考题六、复习思考题1.荧光物质都具有两个特征光谱，即和，二者成关系。激发光谱发射光谱镜像2.波长350nm的入射光激发硫酸奎宁的稀硫酸溶液时，将产生350nm的（）。A 荧光B 瑞利光C 磷光D 拉曼光B3.处于激发态的分子释放能量回到基态的主要途径有、。荧光磷光内部能量转换外部能量转换振动驰豫4.下列物质荧光强度最大的是（）A联苯B萘C蒽D芴D六、复习思考题六、复习思考题5.荧光光谱的特征是什么？答：荧光光谱的特征是（1）荧光波长总是比激发光波长大。（2）荧光光谱的形状与激发光波长无关。（3）荧光光谱与激发光谱呈镜像关系。