《酯酶与氧化酶》PPT课件.ppt

EsteraseEsterase一、基本概念一、基本概念1.定义：定义：酯酶酯酶(Esterase),催化作用于酯类物质的酯健催化作用于酯类物质的酯健,使之使之水解的酶的总称水解的酶的总称,包括磷酸酶包括磷酸酶,羧酸酯水解酶羧酸酯水解酶,硫酸酯硫酸酯水解酶等。水解酶等。羧酸酯水解酶羧酸酯水解酶(Carboxylic ester hydrolase)，是所有，是所有能催化羧酸酯水解的酶的总称（或称酯酶），其作用能催化羧酸酯水解的酶的总称（或称酯酶），其作用是水解脂肪族酯和芳香族酯，催化的反应式：是水解脂肪族酯和芳香族酯，催化的反应式：羧酸2.2.酯和酯键酯和酯键酯由来自酯由来自羧酸的酰基羧酸的酰基和来自和来自醇的烃氧基醇的烃氧基组成，是羧组成，是羧酸与醇反应酸与醇反应失水失水而生成，即羧基上羟基和醇羟基上而生成，即羧基上羟基和醇羟基上的氢共同脱水。通式的氢共同脱水。通式R-CO-ORR-CO-OR，结构上可看作羧酸，结构上可看作羧酸中的羟基被中的羟基被烃氧基（烃氧基（-OR-OR）取代的产物，亦可看作取代的产物，亦可看作醇中羟基的氢原子被醇中羟基的氢原子被酰基（酰基（R-CO-R-CO-）取代的产物。取代的产物。羧酸酰基酰基（R-CO-R-CO-）是含氧酸分子（）是含氧酸分子（RCOOHRCOOH）中）中去掉酸性去掉酸性OHOH后（即能离解出后（即能离解出H H+的的OHOH基）余下的基团。包括丙基）余下的基团。包括丙酰基酰基(丙酸）、苯甲酰基（苯甲酸）、草酰基（草丙酸）、苯甲酰基（苯甲酸）、草酰基（草酸）、苯磺酰基（苯磺酸）、亚硝酰基（亚硝酸）、酸）、苯磺酰基（苯磺酸）、亚硝酰基（亚硝酸）、亚硫酰基（亚硫酸）、磷酰基（磷酸）。亚硫酰基（亚硫酸）、磷酰基（磷酸）。3.3.酯酶与水解反应酯酶与水解反应 羧酸酯酶羧酸酯酶水解水解羧酸酯羧酸酯为为醇醇和和羧酸羧酸芳香酯酶芳香酯酶水解水解乙酸苯酯乙酸苯酯为为酚酚和和乙酸乙酸脂肪酶水解甘油三酯为甘油二酯和脂肪酸脂肪酶水解甘油三酯为甘油二酯和脂肪酸乙酰酯酶水解乙酰酯为醇和乙酸乙酰酯酶水解乙酰酯为醇和乙酸乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶水解水解乙酰胆碱乙酰胆碱为为胆碱胆碱和和乙酸乙酸胆碱酯酶胆碱酯酶水解水解酯酰胆碱酯酰胆碱为为胆碱胆碱和和羧酸羧酸 根据酶对底物、根据酶对底物、pH、激活剂、抑制剂的反应特、激活剂、抑制剂的反应特点，可将酯酶分为点，可将酯酶分为20余种，在生物化学上统称为酯酶，余种，在生物化学上统称为酯酶，只有一部分可用组化的方法证明。通常根据对底物是只有一部分可用组化的方法证明。通常根据对底物是否具有特异性，可分为否具有特异性，可分为特异性特异性与与非特异性酯酶非特异性酯酶两种。两种。分解分解短链短链（C2C4）低级脂肪酸酯）低级脂肪酸酯多为非特异性酯酶，多为非特异性酯酶，如芳香基酯酶、羧酸酯酶和乙酰酯酶。特异性酯酶据如芳香基酯酶、羧酸酯酶和乙酰酯酶。特异性酯酶据其底物特异性可分为，分解其底物特异性可分为，分解长链长链(C8以上）高级脂肪以上）高级脂肪酸酯酸酯的酶称的酶称酯酶酯酶(Lipase)，分解乙酰胆碱的分解乙酰胆碱的乙酰胆碱乙酰胆碱酯酶酯酶，分解酯酰胆碱的，分解酯酰胆碱的胆碱酯酶胆碱酯酶。二、酯酶的分类二、酯酶的分类（一）非特异性酯酶（一）非特异性酯酶(non-specific esterase)：无底物特异性。根据无底物特异性。根据E600,DFP,PCMB对它们对它们的抑制作用不同，分为的抑制作用不同，分为3类类.1.芳香芳香基酯酶基酯酶(Aromesterase)，即，即A-酯酶，亦称有酯酶，亦称有机磷酸抵抗性酯酶机磷酸抵抗性酯酶I。（）底物：（）底物：萘酚乙酯萘酚乙酯萘酚乙酸酯类萘酚乙酸酯类吲哚酚乙酸酯类吲哚酚乙酸酯类（）完全抑制（）完全抑制10mmol/L 磷酸二乙基对硝基苯酯磷酸二乙基对硝基苯酯(E 600)1mmol/L CuSO41mmol/L Pb(NO3)210mmol/L AgNO3100 mol/L 对氯高汞苯甲酸对氯高汞苯甲酸(PCMB)（）激活（）激活mmol/L半胱氨酸半胱氨酸(Cysteine)、脂肪族酯酶（、脂肪族酯酶（aliesterase),即即B-酯酶，酯酶，亦称有亦称有机磷酸敏感性酯酶机磷酸敏感性酯酶（）底物（）底物 萘酚乙酯；萘酚乙酯；萘酚乙酸酯类；萘酚乙酸酯类；吲哚酚乙酸吲哚酚乙酸酯类。酯类。（）完全抑制（）完全抑制10 mol/L磷酸二乙基对硝基苯酯磷酸二乙基对硝基苯酯(E-600)100 mol/L毒扁豆碱毒扁豆碱(Eserine)10mmol/L AgNO3.乙酰酯酶乙酰酯酶(acetylesterase)：即：即C-酯酶，酯酶，又称有机磷酸抵抗性酯酶又称有机磷酸抵抗性酯酶（）底物（）底物吲哚酚乙酸酯类吲哚酚乙酸酯类萘酚萘酚AS乙酸酯类乙酸酯类（）完全抑制（）完全抑制10mmol/L -苯丙酸苯丙酸10mmol/L AgNO31mmol/L CuSO4（）（）激活激活100 mol/L 对氯高汞苯甲酸对氯高汞苯甲酸(PCMB)100 mol/L 苯氯化汞苯氯化汞非特异性酯酶A酯酶B酯酶C酯酶别称芳香/芳基酯酶,有机磷酸抵抗性酯酶羧酸酯酶,芳香族酯酶,有机磷酸敏感性酯酶乙酰酯酶,-SH抑制性抵抗性酯酶,有机磷酸抵抗性酯酶E600(10-4mol/L)抑制PCMB(10-4mol/L)抑制激活（二）特异性酯酶（二）特异性酯酶(Specific esterase)根据底物的特异性分为三种根据底物的特异性分为三种:、脂酶、脂酶(Lipase)底物：高级脂肪酸底物：高级脂肪酸抑制剂：毒扁豆碱抑制剂：毒扁豆碱(eserine)激活剂：激活剂：2.5%牛磺胆酸钠牛磺胆酸钠、胆碱酯酶、胆碱酯酶(cholinesterase)特异性底物：丁酰硫代胆碱特异性底物：丁酰硫代胆碱 抑制剂：四异丙基氨基焦酰胺抑制剂：四异丙基氨基焦酰胺(ISO-OMPA)3、乙酰胆碱酯酶、乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase)底物：底物：乙酰乙酰 甲基硫代胆碱甲基硫代胆碱 乙酰硫代胆碱乙酰硫代胆碱 乙酰基吲哚重氮盐乙酰基吲哚重氮盐 抑制剂：四异丙基氨基焦酰胺抑制剂：四异丙基氨基焦酰胺(ISO-OMPA)酯酶的鉴别酯酶的鉴别、根据底物特异性、根据底物特异性选择特异底物配制孵育液选择特异底物配制孵育液、选择一定浓度的抑制剂或激活剂、选择一定浓度的抑制剂或激活剂通常使用抑制剂的方法是向底物液中通常使用抑制剂的方法是向底物液中加抑制剂或将切片在抑制液中浸渍。加抑制剂或将切片在抑制液中浸渍。（一）显示法（一）显示法 A.A.偶氮色素法偶氮色素法 、反应原理、反应原理在酶作用下，从底物游离出来的在酶作用下，从底物游离出来的-萘酚萘酚ASAS与与重氮重氮盐盐偶联形成偶联形成偶氮色素偶氮色素，同时沉着于酶的存在部位，通，同时沉着于酶的存在部位，通过偶氮色素显色，间接证明酶的存在部位。过偶氮色素显色，间接证明酶的存在部位。-萘酚系统萘酚系统可用重氮盐坚牢蓝，坚牢蓝可用重氮盐坚牢蓝，坚牢蓝RRRR，坚，坚牢红牢红RCRC盐。盐。萘酚萘酚ASAS系统系统用柘榴石（黄色）、用柘榴石（黄色）、GBGB盐、坚牢红盐、坚牢红RCRC、坚牢红紫坚牢红紫LCLC盐。盐。三、非特异性酯酶三、非特异性酯酶2.2.孵育液孵育液 （萘酚（萘酚ASAS乙酸酯法乙酸酯法 Pearse,1972 Pearse,1972）1%1%萘酚萘酚ASAS醋酸盐（丙酮溶液）醋酸盐（丙酮溶液）0.1ml (0.1ml (底物）底物）0.05mol/L PBS(pH 7.0)0.05mol/L PBS(pH 7.0)10ml 10ml（缓冲液）（缓冲液）坚牢蓝坚牢蓝B B盐盐30mg30mg（重氮盐）（重氮盐）搅拌过滤使用搅拌过滤使用3.3.操作步骤操作步骤 (1)(1)新鲜组织恒冷箱切片；新鲜组织恒冷箱切片；(2)(2)入孵液，室温或入孵液，室温或37 20-30min37 20-30min；(3)(3)流水冲洗流水冲洗2min2min；(4)(4)2%2%甲基绿甲基绿复染细胞核；复染细胞核；(5)(5)流水冲洗流水冲洗3-5min3-5min；(6)(6)甘油明胶封固。甘油明胶封固。4.4.结果与评价结果与评价酶活性部位为酶活性部位为黑色黑色，胞核为，胞核为绿色绿色。活性部位的染。活性部位的染色视重氮盐不同而异。坚牢红色视重氮盐不同而异。坚牢红TRTR为紫红色，坚牢红为紫红色，坚牢红RCRC为暗红色，坚牢蓝为暗红色，坚牢蓝RRRR为青铜色。为青铜色。5.5.组织处理说明组织处理说明非特异性酯酶类对固定非特异性酯酶类对固定的抵抗性较强，可用醛类固的抵抗性较强，可用醛类固定液固定后冰冻切片。定液固定后冰冻切片。10%10%福福尔马林钙、尔马林钙、4%4%多聚甲醛磷多聚甲醛磷酸缓冲液或二甲胂酸盐缓冲酸缓冲液或二甲胂酸盐缓冲液，液，pH7.2-7.4;4pH7.2-7.4;4固定固定16-16-1818小时，时间随酶活性强弱小时，时间随酶活性强弱不同。不同。-醋酸萘酚酯醋酸萘酚酯 萘酚萘酚ASAS乙酸酯乙酸酯 坚牢蓝坚牢蓝B B盐盐 坚牢蓝坚牢蓝BBBB盐盐B.B.偶氮吲哚酚法偶氮吲哚酚法1.1.反应原理反应原理在非特异性酯酶作用下，在非特异性酯酶作用下，醋酸吲哚酚酯醋酸吲哚酚酯被水解为被水解为吲哚酚吲哚酚和和醋酸醋酸，吲哚酚与，吲哚酚与六氮盐六氮盐偶联成偶联成偶氮色素偶氮色素。吲哚酚酯吲哚酚酯吲哚酚吲哚酚羧酸羧酸+六氮盐六氮盐 偶氮色素偶氮色素2.2.孵育液孵育液醋酸吲哚酚醋酸吲哚酚 3mg 3mg二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺 0.3ml 0.3ml六氮化副蔷薇苯胺缓冲液六氮化副蔷薇苯胺缓冲液10ml10ml（六氮化副蔷薇苯胺六氮化副蔷薇苯胺0.3ml0.3ml溶于溶于0.1mol/L 0.1mol/L PBSPBS pH5-6,pH5-6,用用1mol/L-0.1mol/L 1mol/L-0.1mol/L NaOHNaOH将将pHpH调调至至5-5.55-5.5，混匀过滤立即使用。），混匀过滤立即使用。）3.3.操作步骤操作步骤(1)(1)恒冷箱切片入孵液，恒冷箱切片入孵液，3715-60min3715-60min；(2)(2)蒸馏水洗；蒸馏水洗；(3)4%(3)4%甲醛固定数小时；甲醛固定数小时；(4)(4)甘油明胶封固。甘油明胶封固。4.4.结果结果酶活性处呈红棕色酶活性处呈红棕色腹水癌细胞中的酯酶腹水癌细胞中的酯酶巨噬细胞中的酯酶巨噬细胞中的酯酶C.吲哚酚法吲哚酚法(靛蓝法靛蓝法)Pearse,1972 .原理原理醋酸吲哚酚经酶水解释放出吲哚酚，再氧化形成靛醋酸吲哚酚经酶水解释放出吲哚酚，再氧化形成靛蓝沉着于酶所在部位。蓝沉着于酶所在部位。底物底物:5-5-溴溴-6-6-氯吲哚酚乙酸酯氯吲哚酚乙酸酯,5-5-溴吲哚酚乙酸酯溴吲哚酚乙酸酯等等.氧化剂氧化剂:铁氰化钾、亚铁氰化钾铁氰化钾、亚铁氰化钾.孵育液孵育液(1)(1)醋酸溴吲哚酚酯醋酸溴吲哚酚酯2mg2mg(2)(2)二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺0.2ml0.2ml(3)(3)储备液储备液10ml10ml储备液配制：储备液配制：铁氰化钾铁氰化钾(1.65%)(1.65%)5ml5ml亚铁氰化钾亚铁氰化钾(2.11%)(2.11%)5ml5ml0.1mol/L Tris-HCL0.1mol/L Tris-HCL缓冲液缓冲液pH6.8pH6.820ml20ml2%CaCL2%CaCL2 210ml10ml蒸馏水蒸馏水10ml10ml3.3.操作步骤操作步骤(1)(1)新鲜组织恒冷箱切片；新鲜组织恒冷箱切片；(2)(2)切片入孵育液，切片入孵育液，3737或室温或室温 5-120min5-120min；(3)(3)蒸馏水洗；蒸馏水洗；(4)(4)甘油明胶封固。甘油明胶封固。4.4.结果结果酶活性部位呈酶活性部位呈青绿色青绿色，背底无色。，背底无色。.注意注意铁氰化钾氧化吲哚酚除产生靛蓝外，还有无色产物。铁氰化钾氧化吲哚酚除产生靛蓝外，还有无色产物。因此酶活性与显色无平行关系，因此酶活性与显色无平行关系，可定性不可定量。可定性不可定量。肾间质细胞肾间质细胞 油螺卵母细胞油螺卵母细胞 底物：底物：5-5-溴吲哚酚乙酸酯溴吲哚酚乙酸酯主要定位于主要定位于内质网内质网和和溶酶体溶酶体，生理功能尚不清楚，生理功能尚不清楚,目前认为目前认为主要参与酯类和蛋白质代谢。主要参与酯类和蛋白质代谢。极强阳性：极强阳性：胰腺胰腺外分泌部腺细胞外分泌部腺细胞，横纹肌，横纹肌运动终板运动终板，小肠小肠 上皮上皮细胞；细胞；强阳性：强阳性：肝细胞，肝细胞，肾近曲小管上皮肾近曲小管上皮，结肠上皮细胞；，结肠上皮细胞；阳性：胰腺和腮腺导管上皮，食管上皮，肠腺上皮，肺泡阳性：胰腺和腮腺导管上皮，食管上皮，肠腺上皮，肺泡 巨噬细胞，睾丸间质细胞。巨噬细胞，睾丸间质细胞。弱阳性：心肌细胞，胰岛细胞，胆管、甲状腺、气管、支弱阳性：心肌细胞，胰岛细胞，胆管、甲状腺、气管、支 气管、膀胱等上皮细胞。气管、膀胱等上皮细胞。（二）非特异性酯酶的生物学意义（二）非特异性酯酶的生物学意义特异性酯酶脂酶乙酰胆碱酯酶胆碱酯酶底物高级脂肪酸乙酰胆碱，乙酰-基甲基胆碱乙酰胆碱，苯甲酰胆碱，长链脂肪酸胆碱抑制剂毒扁豆碱异丙基氨基焦酰胺(ISO-OMPA)四异丙基氨基焦酰胺激活剂2.5%牛磺胆酸钠广义的广义的胆碱酯酶胆碱酯酶包括包括乙酰胆碱酯酶（乙酰胆碱酯酶（AChE)和狭义的和狭义的胆碱胆碱酯酶酯酶(ChE)，两者化学性质不同，用酯来检测底物特异性时，两者化学性质不同，用酯来检测底物特异性时，乙乙酰胆碱酯酶酰胆碱酯酶能最快地促使能最快地促使乙酰胆碱分解乙酰胆碱分解，也能水解乙酰，也能水解乙酰-基甲基甲基胆碱，但不能水解苯甲酰胆碱，此酶能被基胆碱，但不能水解苯甲酰胆碱，此酶能被高浓度的乙酰胆碱高浓度的乙酰胆碱抑制抑制。但。但胆碱酯酶胆碱酯酶却不同，却不同，乙酰胆碱浓度越高乙酰胆碱浓度越高，越能被胆碱酯，越能被胆碱酯酶所分解。酶所分解。ChE还能水解苯甲酰胆碱，但不能水解乙酰还能水解苯甲酰胆碱，但不能水解乙酰-基甲基甲基胆碱。基胆碱。乙酰胆碱乙酰胆碱+H+H2 2O O 胆碱胆碱+醋酸醋酸酯酰胆碱酯酰胆碱+H+H2 2O O 胆碱胆碱+羧酸羧酸AChEChE四、乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶四、乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶(Acetylcholinesterase and Cholinestrase,AChE and ChE)乙酰胆碱酯酶胆碱酯酶乙酰胆碱（快）高浓度时抑制其活性高浓度不抑制其活性乙酰-基甲基胆碱苯甲酰胆碱（快）长链脂肪酸胆碱（快）AChE 和和 ChE的底物特异性的底物特异性（一）显示方法（一）显示方法亚铁氰化铜法亚铁氰化铜法1 1、反应原理、反应原理利用乙酰胆碱酯酶能将利用乙酰胆碱酯酶能将乙酰胆碱盐乙酰胆碱盐水解产生硫水解产生硫代胆碱，使铁氰化物还原为代胆碱，使铁氰化物还原为亚铁氰化物亚铁氰化物，再与铜离，再与铜离子结合形成子结合形成亚铁氰化铜亚铁氰化铜显色沉淀，证明酶活性的存显色沉淀，证明酶活性的存在。在。乙酰胆碱盐乙酰胆碱盐AChE硫代胆碱硫代胆碱若用若用四异丙基焦磷酰胺四异丙基焦磷酰胺抑制胆碱酯酶，可单独显抑制胆碱酯酶，可单独显示乙酰胆碱酯酶。示乙酰胆碱酯酶。铁氰化钾铁氰化钾亚铁氰化钾亚铁氰化钾+Cu2+亚铁氰化铜亚铁氰化铜、孵育液、孵育液乙酰硫代胆碱碘盐乙酰硫代胆碱碘盐5mg5mg0.1mol/L0.1mol/L醋酸缓冲液醋酸缓冲液pH5.5pH5.56.5ml6.5ml0.1mol/L(2.94%)0.1mol/L(2.94%)柠檬酸钠柠檬酸钠0.5ml0.5ml30mmol/L(0.75%)CuSO30mmol/L(0.75%)CuSO4 41.0ml1.0ml5mmol/L(0.164%)5mmol/L(0.164%)铁氰化钾铁氰化钾1.0ml1.0ml 蒸馏水蒸馏水1.0ml1.0ml乙酰胆碱碘盐完全溶解于醋酸缓冲液后，依次加乙酰胆碱碘盐完全溶解于醋酸缓冲液后，依次加入其它溶液，入其它溶液，临用前不超过临用前不超过3030分钟内配制分钟内配制，充分混匀，充分混匀，至溶液呈亮绿色，最终至溶液呈亮绿色，最终pH5.5pH5.5。、操作步骤、操作步骤(1)(1)新鲜组织恒冷箱切片；新鲜组织恒冷箱切片；(2)(2)冷丙酮或冷丙酮或10%10%福尔马林固定福尔马林固定20-25min20-25min；(3)(3)蒸馏水洗；蒸馏水洗；(4)(4)入孵育液入孵育液3737，h h；(5)(5)蒸馏水洗；蒸馏水洗；(6)(6)甘油明胶封固。甘油明胶封固。、结果与评价、结果与评价乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶活性部位显乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶活性部位显棕色沉淀棕色沉淀。CuCu2+2+浓度太小易弥散，浓度太小易弥散，pH5-5.5pH5-5.5，高于易扩散。，高于易扩散。、对照、对照用用四异丙基焦磷酰胺四异丙基焦磷酰胺4mM(0.137%)0.2ml4mM(0.137%)0.2ml抑制胆抑制胆碱酯酶碱酯酶显示乙酰胆碱酯酶；显示乙酰胆碱酯酶；用用毒扁豆碱硫酸酯毒扁豆碱硫酸酯310310-5-5M M代替蒸馏水，先将切代替蒸馏水，先将切片处理片处理3030分，水洗后入孵育液，则分，水洗后入孵育液，则二种酶均被抑制二种酶均被抑制呈呈阴性。阴性。(二）生物学意义二）生物学意义胆碱酯酶的活性中心是胆碱酯酶的活性中心是丝氨酸丝氨酸。乙酰胆碱酯酶。乙酰胆碱酯酶活性的强弱是活性的强弱是神经细胞性质和功能的重要参考指标神经细胞性质和功能的重要参考指标，亦是神经系统发生过程中的亦是神经系统发生过程中的神经细胞分化神经细胞分化的一个指的一个指标，所以在形态上将乙酰胆碱酯酶的组织化学显示标，所以在形态上将乙酰胆碱酯酶的组织化学显示作为作为胆碱能传递部位的标志。胆碱能传递部位的标志。AChEAChE是是生物神经传导生物神经传导中的一种关键性的酶，在中的一种关键性的酶，在胆碱能突触间，该酶降解乙酰胆碱，终止神经递质胆碱能突触间，该酶降解乙酰胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。的正常传递。AChEAChE与细胞凋亡与细胞凋亡有一定的关系。在细胞水平发有一定的关系。在细胞水平发现实验所用的各类细胞，正常状态没有现实验所用的各类细胞，正常状态没有AChEAChE活性反活性反应，一旦发生凋亡，都有应，一旦发生凋亡，都有AChEAChE活性反应。用其特异活性反应。用其特异的抑制剂可以抑制其活性反应。用的抑制剂可以抑制其活性反应。用RT-PCRRT-PCR方法证明方法证明了凋亡细胞有了凋亡细胞有AChEmRNAAChEmRNA的转录。加入其抑制剂石杉的转录。加入其抑制剂石杉碱可降低凋亡基因的表达。碱可降低凋亡基因的表达。乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶主要分布于主要分布于神经系统（大脑皮质神经系统（大脑皮质中有中有AChEAChE阳性的神经纤维，还存在于胆碱能神经元阳性的神经纤维，还存在于胆碱能神经元中）中）、神经、神经肌肉接头处肌肉接头处、红细胞红细胞等，而等，而胆碱酯酶胆碱酯酶主主要分布于要分布于血清血清、胰腺胰腺、唾液腺内唾液腺内。五、胆碱乙酰转移酶五、胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,ChAc)此酶不属于羧酸酯水解酶，它是此酶不属于羧酸酯水解酶，它是乙酰乙酰胆碱的合成酶胆碱的合成酶。胆碱乙酰转移酶的强弱是。胆碱乙酰转移酶的强弱是胆碱能神经生理功能的标志，因此将胆碱能神经生理功能的标志，因此将ChACChAC确认为胆碱能神经的标志酶。确认为胆碱能神经的标志酶。（一）显示方法（一）显示方法BurtBurt法法1 1、反应原理、反应原理 胆胆碱碱乙乙酰酰转转移移酶酶可可把把乙乙酰酰胆胆碱碱辅辅酶酶A A的的乙乙酰酰基基转转移移到到胆胆碱碱分分子子上上,合合成成乙乙酰酰胆胆碱碱。辅辅酶酶A A被被游游离离出出来来，辅辅酶酶A A中的中的SHSH被铅离子沉淀而显示酶的活性。被铅离子沉淀而显示酶的活性。乙酰辅酶乙酰辅酶A+A+胆碱胆碱 乙酰胆碱乙酰胆碱+辅酶辅酶A A Pb Pb2+2+沉淀产物沉淀产物 PbS PbS 硫化铵硫化铵ChAc2 2、孵育液、孵育液25mmol/L N-2-羟基乙基哌嗪羟基乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲乙烷磺酸缓冲 液液（HEPES）pH6.04mmol/L 胆碱胆碱（48.5mg/100ml缓冲液）缓冲液）0.2mmol/L 乙酰胆碱辅酶乙酰胆碱辅酶A（16.2mg/100ml缓冲液）缓冲液）18mmol/L 硝酸铅硝酸铅（59.6mg/100ml缓冲液）缓冲液）0.1mmol/L Phospholine iodide(乙酰胆碱酯酶抑乙酰胆碱酯酶抑 制剂）（制剂）（3.8mg/100 ml缓冲液）缓冲液）最终最终pH值为值为6.0。3 3、操作步骤、操作步骤（1）固固定定：8m厚厚的的冰冰冻冻切切片片在在10%蔗蔗糖糖和和2%戊戊二二醛醛的的25mmol/LHEPES缓缓冲冲液液（pH7.0）中中固固定定5min；（2）漂漂 洗洗：用用 含含 10%蔗蔗 糖糖 的的 HEPES缓缓 冲冲 液液 洗洗15min3；（3）孵孵育育：切切片片入入孵孵育育液液中中，室室温温，3h；（30，15-30min）；）；（4）蒸馏水洗）蒸馏水洗3次；次；（5）1%硫化铵显色硫化铵显色2min；（6）缓冲液漂洗，甘油明胶封固。）缓冲液漂洗，甘油明胶封固。4 4、结果：、结果：酶活性部位呈黑色沉淀。酶活性部位呈黑色沉淀。5 5、对照：、对照：（1 1）孵育液中可除去辅酶）孵育液中可除去辅酶A A；（2 2）孵育液中去除胆碱，反应结果为阴性。）孵育液中去除胆碱，反应结果为阴性。（二）生物学意义（二）生物学意义 ChAc ChAc是是胆碱能神经元的标志酶胆碱能神经元的标志酶，是乙酰胆碱的合，是乙酰胆碱的合成酶，分布在成酶，分布在胆碱能神经元和纤维内胆碱能神经元和纤维内，其含量的多少，其含量的多少，可说明可说明神经兴奋性的高低神经兴奋性的高低，能充分反映神经的功能。，能充分反映神经的功能。是了解胆碱能神经元及其所支配器官的重要指标。是了解胆碱能神经元及其所支配器官的重要指标。AChEAChE是乙酰胆碱的水解酶，其特性没有是乙酰胆碱的水解酶，其特性没有ChAcChAc高，两酶高，两酶相结合作观察指标最为理想。相结合作观察指标最为理想。六、脂酶六、脂酶(Lipase)(Lipase)脂酶又名甘油酯水解酶，能催化脂酶又名甘油酯水解酶，能催化长链脂肪酸甘油酯长链脂肪酸甘油酯或其它或其它醇酯醇酯水解。水解。激活剂：激活剂：CaCa2+2+、SrSr2+2+、MgMg2+2+、半胱氨酸、巯基乙酸、牛磺胆、半胱氨酸、巯基乙酸、牛磺胆酸盐。酸盐。（一）显示方法（一）显示方法硫化铅法（吐温法之一，硫化铅法（吐温法之一，Gomori,1954)Gomori,1954)、基本原理、基本原理以长链脂肪酸酯为底物，在脂酶作用下，分离出的脂肪酸以长链脂肪酸酯为底物，在脂酶作用下，分离出的脂肪酸可与钙形成钙皂沉淀，再用铅置换钙，最后经硫化胺置换生成可与钙形成钙皂沉淀，再用铅置换钙，最后经硫化胺置换生成棕黑色硫化铅沉淀。棕黑色硫化铅沉淀。吐温吐温脂酶脂酶脂肪酸脂肪酸+Ca2+钙皂钙皂铅置换钙铅置换钙硫化胺硫化胺PbS、孵育液、孵育液5%5%吐温吐温6060或或8080硬脂酸酯（油酸酯）硬脂酸酯（油酸酯）2ml2ml0.2mol/L Tris0.2mol/L Tris缓冲液缓冲液(pH7.2-7.4)(pH7.2-7.4)5ml5ml10%10%氯化钙氯化钙2ml2ml蒸馏水蒸馏水40ml40ml、操作步骤、操作步骤(1)(1)恒冷箱切片；恒冷箱切片；(2)(2)入孵育液，入孵育液，37,37,小时；小时；(3)1%CaCL(3)1%CaCL液内浸洗，使钙皂不溶；液内浸洗，使钙皂不溶；(4)1%Pb(NO(4)1%Pb(NO3 3)2 2浸浸15min15min，（置换）；（置换）；(5)(5)流水冲洗流水冲洗5 5分；分；(6)0.5-1%(6)0.5-1%硫化胺液内硫化胺液内minmin，（显色）（显色）；(7)(7)水洗分；水洗分；(8)(8)甘油明胶封片。甘油明胶封片。、结果与评价、结果与评价棕黑色棕黑色硫化铅沉淀为脂酶活性所在部硫化铅沉淀为脂酶活性所在部位。本法需位。本法需保持保持CaCa2+2+浓度浓度，才有利于在，才有利于在Pb(NOPb(NO3 3)2 2液内进行充分置换反应。孵化时间液内进行充分置换反应。孵化时间过长，易弥散。过长，易弥散。、对照、对照去出吐温去出吐温6060（底物）为阴性（底物）为阴性（二）生物学意义（二）生物学意义 脂脂酶酶在在体体内内主主要要催催化化甘甘油油三三酯酯水水解解，使使之之成成为为二二酰酰甘甘油油和和脂脂肪肪酸酸，甘甘油油三三酯酯必必须须在在脂脂酶酶将将它它分分解解成成甘甘油油和和脂脂肪肪酸酸后后，才才能能被被肠肠道道吸吸收收。脂脂肪肪细细胞也需要脂酶水解脂肪，以保证脂肪的外运。胞也需要脂酶水解脂肪，以保证脂肪的外运。脂酶的定位和组织分布：脂酶的定位和组织分布：脂酶主要存在于胞脂酶主要存在于胞质的基质，高尔基复合体和线粒体也可出现阳性质的基质，高尔基复合体和线粒体也可出现阳性反应。反应。胰腺胰腺最为丰富，其次是最为丰富，其次是肝脏、肾脏、脾脏肝脏、肾脏、脾脏、唾液腺导管唾液腺导管（但大鼠极少）、胃贲门、睾丸基质（但大鼠极少）、胃贲门、睾丸基质细胞中也存在。细胞中也存在。Oxidase and DehydrogenaseOxidase and Dehydrogenase一、氧化还反应一、氧化还反应1.1.生物体内的氧化方式生物体内的氧化方式(1)(1)脱电子反应：脱电子反应：从底物上脱落一个电子。从底物上脱落一个电子。Fe Fe 2+2+Fe Fe 3+3+e+e(2)(2)脱氢反应：脱氢反应：从底物上脱落一对氢原子。从底物上脱落一对氢原子。MHMH2 2 M+2H(2H M+2H(2H+2e)+2e)(3)(3)加氧反应：加氧反应：向底物中直接加入氧原子或氧分子。向底物中直接加入氧原子或氧分子。催化上述反应的酶，称催化上述反应的酶，称氧化还原酶氧化还原酶。受电子体、受氢体与供电子体、供氢体受电子体、受氢体与供电子体、供氢体氧化反应：氧化反应：分解代谢分解代谢中失电子、脱氢、加氧。中失电子、脱氢、加氧。还原反应：还原反应：合成代谢合成代谢中得电子、加氢、脱氧。中得电子、加氢、脱氧。还原剂：还原剂：供电子体供电子体FeFe2+2+(亚铁离子）。亚铁离子）。氧化剂：氧化剂：受电子体（或受氢体受电子体（或受氢体)Fe)Fe3+3+(高铁离子）。高铁离子）。根据根据受氢体的不同受氢体的不同，氧化还原酶分为：，氧化还原酶分为：氧化酶氧化酶：催化氢原子直接转移到：催化氢原子直接转移到氧分子氧分子上。上。脱氢酶脱氢酶：催化氢原子转移到：催化氢原子转移到其它受氢体上其它受氢体上，催，催化氧化过程的中间环节。化氧化过程的中间环节。常见的受氢体有：常见的受氢体有：辅酶辅酶（NADNAD+，nicotinamide adenine nicotinamide adenine dinucleotide,dinucleotide,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸）；尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸）；辅酶辅酶（NADPNADP+,nicotinamide adenine,nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,dinucleotide phosphate,尼克酰胺腺嘌呤尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）；二核苷酸磷酸）；黄素腺嘌呤二核苷酸黄素腺嘌呤二核苷酸(FADFAD,Flavin-,Flavin-adenine dinucleotide)adenine dinucleotide)2.2.电子传递链电子传递链营养物质在线粒体内经营养物质在线粒体内经三羧酸循环、脂肪酸氧化三羧酸循环、脂肪酸氧化等不同氧化分解途径，等不同氧化分解途径，脱氢氧化脱氢氧化。脱下的氢大多由。脱下的氢大多由NADNAD+、NADPNADP+、FADFAD接受，接受，NADNAD+、FADFAD是常见是常见脱氢酶脱氢酶的的辅酶或辅基。这些辅酶或辅基。这些脱氢酶是连接代谢途径和电子传脱氢酶是连接代谢途径和电子传递链的环节递链的环节。代谢物脱下一对氢，分别以。代谢物脱下一对氢，分别以NADH+HNADH+H+或或FADHFADH2 2进入进入电子传递链电子传递链，最终与，最终与氧结合生成水氧结合生成水，并，并释放能量。释放能量。电子电子只能从电子亲和力只能从电子亲和力低低的传递体向亲的传递体向亲和力和力高高的传递体传递。的传递体传递。二、细胞色素氧化酶二、细胞色素氧化酶(Cytochrome Oxidase,CCO)细胞色素细胞色素(Cytochrome,cyt)是生物细胞内一类传是生物细胞内一类传递蛋白质，含有铁呋啉辅基，具有红色而取名细胞递蛋白质，含有铁呋啉辅基，具有红色而取名细胞色素。色素。电子传递链中有电子传递链中有5种不同细胞色素：种不同细胞色素：b、c、c1、a、a3，b、c、c1的辅基都含铁原呋呤（血红素）的辅基都含铁原呋呤（血红素），铁原子与呋呤环和蛋白质形成六个配位键，不能，铁原子与呋呤环和蛋白质形成六个配位键，不能再与氧结合。再与氧结合。细胞色素细胞色素是一种水溶性的是一种水溶性的膜表面蛋白膜表面蛋白，还原性，还原性的细胞色素把它的的细胞色素把它的电子传递给细胞色素氧化酶电子传递给细胞色素氧化酶CytaaCytaa3 3，细胞色素，细胞色素a a和和a a3 3结合紧密，一般分离方法不结合紧密，一般分离方法不能将它们分开，形成一个大分子寡聚体，通常称为能将它们分开，形成一个大分子寡聚体，通常称为细胞色素细胞色素aaaa3 3,FeFe与呋呤环和蛋白质形成五个配位与呋呤环和蛋白质形成五个配位键，还保留一个配位键和键，还保留一个配位键和O O2 2、COCO和和CNCN-（氰基）结合，（氰基）结合，是电子传递链中是电子传递链中能与氧进行反应能与氧进行反应的复合物，能催化的复合物，能催化分子分子氧接受电子而被还原氧接受电子而被还原，称，称细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶或或细细胞色素氧化酶胞色素氧化酶。细胞色素氧化酶使还原的细胞色素再氧化，是细胞色素氧化酶使还原的细胞色素再氧化，是线粒体的结构成分之一。线粒体的结构成分之一。（一）显示方法（一）显示方法1、Nadi氧化酶反应（氧化酶反应（Naphthol-diamine,萘酚二胺）萘酚二胺）（1）反应原理）反应原理O2（2 2）孵育液）孵育液 N-N-苯基苯基-对苯二胺对苯二胺 （底物）（底物）3mg 3mg 1-1-羟基羟基-2-2-萘酚萘酚 3mg 3mg 二甲基亚砜二甲基亚砜 0.1ml 0.1ml0.05mol/L0.05mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液pH7.2 10mlpH7.2 10ml混匀，过滤。混匀，过滤。（3 3）操作步骤：）操作步骤：1 1）新鲜组织，恒冷箱切片；）新鲜组织，恒冷箱切片；2 2）入孵育液中，室温，）入孵育液中，室温，2030min2030min；3 3）入）入LugolLugol碘液碘液2min2min；（稳定有色产物）（稳定有色产物）4 4）入）入5%5%硫代硫酸钠溶液硫代硫酸钠溶液4min4min；（脱碘）（脱碘）5 5）入）入1%1%醋酸钴液中醋酸钴液中60min60min；（有色产物螯合）（有色产物螯合）6 6）D.WD.W洗；洗；7 7）甘油明胶封固。）甘油明胶封固。（4 4）结果：）结果：酶活性部位呈棕黑色颗粒。酶活性部位呈棕黑色颗粒。（5 5）对照：）对照：标本孵育于含氰化钾（标本孵育于含氰化钾（0.0065g/10ml)0.0065g/10ml)的孵育液中，呈阴性反应。的孵育液中，呈阴性反应。2.二氨基联苯胺法二氨基联苯胺法（DAB法法,diaminobenzidine）1、原理、原理细胞色素氧化酶（细胞色素氧化酶（CCO）能催化）能催化DAB，被，被H2O2氧化，在新鲜或固定标本上生成氧化，在新鲜或固定标本上生成棕色沉淀。棕色沉淀。DAB盐酸盐溶于水后无色透明，但由于盐酸盐溶于水后无色透明，但由于CCO的的作用，作用，侧链氨基被氧化侧链氨基被氧化，进行反复，进行反复氧化性聚合氧化性聚合和和氧化性环化氧化性环化，形成不溶性，形成不溶性褐色吩嗪褐色吩嗪(phenazine)聚聚合体。合体。(2)(2)孵育液孵育液 蒸馏水蒸馏水 5ml 5ml 3,3-3,3-二氨基联苯胺二氨基联苯胺-4-4盐酸盐盐酸盐 5mg 5mg 0.2mol/L 0.2mol/L磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH7.4)5mlpH7.4)5ml 过氧化氢酶过氧化氢酶 c-100 1mg c-100 1mg 或或 c-40 4mg c-40 4mg 细胞色素细胞色素C IIIC III型型 10mg 10mg 或或 IV 5mg IV 5mg（3 3）操作步骤：）操作步骤：1 1）组织块浸泡固定：戊二醛固定液（）组织块浸泡固定：戊二醛固定液（3%3%戊戊二醛，二醛，0.1mol/L PB pH7.4,0.05%CaCl0.1mol/L PB pH7.4,0.05%CaCl2 2，二甲砷二甲砷酸盐缓冲液），酸盐缓冲液），44，10min;10min;2 2）洗涤：冷固定液）洗涤：冷固定液15min15min，3 3次；次；3 3）恒冷箱切片；）恒冷箱切片；4 4）孵育：）孵育：37 37，40-60min40-60min，充分洗涤；，充分洗涤；5 5）复染；）复染；6 6）封片。）封片。（4 4）结果）结果 酶活性部位呈酶活性部位呈茶褐色茶褐色沉淀，细胞内线粒体数沉淀，细胞内线粒体数目多者酶活性强。目多者酶活性强。（5 5）对照对照 孵育液内加孵育液内加1mM K-CN1mM K-CN或或10mM NaN10mM NaN3 3，反应完全，反应完全呈阴性呈阴性。抑制剂为氰化物、迭氮化钠（。抑制剂为氰化物、迭氮化钠（NaNNaN3 3）、）、硫化氢（硫化氢（H H2 2S S）、一氧化碳，原因是这些物质均能）、一氧化碳，原因是这些物质均能与细胞色素氧化酶的三价铁结合而抑制酶活性。与细胞色素氧化酶的三价铁结合而抑制酶活性。从反应液中从反应液中去掉底物去掉底物DABDAB不能成为对照不能成为对照，因为，因为DABDAB同时也是成色剂。同时也是成色剂。DAB DAB将氧化型细胞色素还原，还原型细胞将氧化型细胞色素还原，还原型细胞色素又被细胞色素色素又被细胞色素a a再氧化，反复循环进行，再氧化，反复循环进行，DABDAB不断被氧化，反应氧化物沉淀沉积。不断被氧化，反应氧化物沉淀沉积。此法从反应特异性、重复性和电镜应用等此法从反应特异性、重复性和电镜应用等方面最好，用得最普遍。方面最好，用得最普遍。DAB DAB法是研究法是研究代谢旺盛细胞线粒体代谢旺盛细胞线粒体的有效手的有效手段。段。骨骼肌骨骼肌DAB法显示法显示CCO肾皮质肾皮质肾髓质肾髓质（二）生物学意义（二）生物学意义 几乎所有组织细胞都呈阳性反应，其几乎所有组织细胞都呈阳性反应，其强度取强度取决于细胞内的线粒体数目决于细胞内的线粒体数目，是，是线粒体的标志酶之线粒体的标志酶之一一。是研究代谢旺盛细胞线粒体的有效手段。是研究代谢旺盛细胞线粒体的有效手段。心心肌、肾小管上皮、胃壁细胞、肝细胞肌、肾小管上皮、胃壁细胞、肝细胞活性均较高，活性均较高，恶性肿瘤恶性肿瘤和癌前期酶活性有增高趋势。和癌前期酶活性有增高趋势。三、三、DOPA氧化酶氧化酶(Catechol Oxidase)也称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶。也称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶。1、反应原理、反应原理以以DOPA(dihydroxyphenylalanine,二羟苯基二羟苯基丙氨酸）为底物，氧化后经一系列复杂反应生丙氨酸）为底物，氧化后经一系列复杂反应生成黑色产物。成黑色产物。2、孵育液孵育液5.6mmon/L二羟苯基丙