DNA酶切、回收和连接.ppt

实验七实验七 基因片段的亚克隆基因片段的亚克隆(DNA(DNA的酶切、回收和连接的酶切、回收和连接）一一.实验目的实验目的1.掌握DNA酶切的基本原理。2.学习和了解限制性内切酶的使用方法。3.学习和掌握DNA片段胶回收的方法 二二.实验原理实验原理 1.核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链DNA中特定碱基序列的核酸水解酶，它们的功能类似于高等动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的侵袭。现已发现几百种限制性内切酶，它们以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5端为P，3端为OH。由于限制性内切酶能识别DNA特异序列并进行切割，因而在基因重组、DNA序列分析、基因组甲基化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技术中收到广泛应用。2.DNA2.DNA的酶切反应的酶切反应分子生物学中经常使用的是II型限制性内切酶。它能识别双链DNA分子中特定的靶序列（48bp),并在该序列内切断DNA，形成特有的粘末端或平端。3.DNA的连接的连接在T4DNA连接酶的作用下，平端或带有相同粘末端的DNA分子可以连接上。DNA连接酶的作分三步：T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物。酶-AMP复合物再结合到具有5-磷酸基和3羟基切口的DNA分子上，使DNA腺苷化。产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。三三.试剂与器材试剂与器材一试剂一试剂1.限制性内切酶EcoRI,HindIII；10内切酶缓冲液2.T4DNA连接酶；10连接酶缓冲液3.电泳缓冲液（0.5TBE或1TAE）4.琼脂糖；溴酚兰；溴化乙锭(工作浓度0.5g/ml)5.酚；氯仿；无水乙醇；70%乙醇；灭菌双蒸水Note:1.Concentration:20,000and100,000units/ml.AssayedonlambdaDNA2.StorageConditions:250mMNaCl,10mMTris-HCl(pH7.4),0.1mMEDTA,1mMdithiothreitol,0.5mg/mlBSA,and50%glycerol.Storeat-20C3.DiluentCompatibility:DiluentB4.HeatInactivation:65Cfor20minutes5.Notsensitivetodam,dcmormammalianCpGmethylation6.Conditionsoflowionicstrength,highenzymeconcentration,glycerolconcentration5%orpH8.0mayresultinstar activity双酶切双酶切buffer的选用的选用二实验器材二实验器材1电泳仪、电泳槽、紫外检测仪、摄影设备2恒温水浴槽 四.操作步骤1.酶切反应设计酶切体积为2030l，计算清楚酶切系统中各成分的用量，清晰做好记录，如果是同一条件下进行多个酶切反应，建议统一加好共同的组分后，分装；先加入正确体积的无菌双蒸水，加入1/10体积的10 x酶切缓冲液，混匀；在冰浴条件下加入适量的限制性内切酶；加入适量的DNA样品；弹匀，短暂离心；置所用限制性内切酶最适温度水浴中，酶切13小时，酶切过夜则建议改用稍大的酶切体积，以避免水分蒸发过多影响的酶切体系各组分浓度改变过大;置65水浴中10分钟，对限制性内切酶进行灭活，不同的酶灭活条件可能不同，请参照说明书进行;进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应的结果;反应体系：10内切酶缓冲液2lDNA1-1.5g限制性内切酶2-5单位用灭菌的ddH2O补至20l，371小时。可根据需要按比例放大。pGFPuv和和pBSK的酶切体系：的酶切体系：酶酶切体系切体系质质粒粒载载体（体（pGFPuvpGFPuv和和pBSKpBSK）10REbuffer(E)10REbuffer(E)6 6 l l100BSA100BSA0.60.6 l lDNADNA6 6 g gEcoREcoRI I0.60.6 l lHindHindIIIIII0.60.6 l lddHddH2 2O OXX l l合合计计6060 l l充分混匀后，用离心机短时（10秒）离心，于37保温3-4小时或过夜，65保温10分钟使限制性内切酶失活。五五.注意事项注意事项 酶的定义酶的定义:在标准条件下,1小时完全消化1g线型DNA分子所需的酶量定义为1U；影响限制性内切酶活性的生物因子：影响限制性内切酶活性的生物因子：1.酶切割位点周围核苷酸两侧的碱基的性质；2.识别序列在DNA中的分布频率；3.与DNA的构象有关（SC,L,OC）；4.DNA的纯度（蛋白、氯仿、SDS、EDTA、甘油等）；影响限制性内切酶活性的生物因子：影响限制性内切酶活性的生物因子：5.内切酶用量不超过总反应体积的10%；6.消化时间适当延长有利于提高酶活性；7.加DNAse-free的BSA 可以起到稳定酶活性的作用；8.用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活性；9.酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可使用；10.DNA样品应不含重金属离子。六六.DNADNA片段的胶回收片段的胶回收电泳洗脱法低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法冻融回收法玻璃奶回收法柱回收法（按说明书进行）Gel ExtractionProtocol胶回收后用30-50 l无菌双蒸水洗脱DNA片段，取1-5 l进行电泳检测，取2-5 l测定OD260nm下的光吸收值，计算DNA的浓度。注：1 OD(260nm)相当于双链DNA浓度为50 g/ml七七.胶回收注意事项胶回收注意事项1.将电泳槽用ddH2O反复清洗干净,倒入新鲜配制的灭菌电极缓冲液；2.根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板；3.切胶时尽可能切掉不含DNA片段的凝胶；4.要尽量减少DNA在紫外下的照射时间以减少对DNA的损伤；5.熔胶要完全。周四：熟悉实验原理及步骤，清洗三角瓶、量筒等器皿，装枪头，1.5/0.5 ml离心管，装牙签及配溶液等 50TAE:500 ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0):500 ml 1mol/L Tris.Cl(pH8.0):500 ml 0.1mol/L CaCl2:500 ml ddH2O:每组100 ml 5 mol/LNaOH:100 ml 配LB培养基 液体：全班1000 ml 150 ml4 瓶（Amp+），用于两个质粒的接种 100 ml 4瓶(Amp-)，留做感受态细胞 固体（含1.5%琼脂粉）：每组100 ml，共1200ml，可一起配再分装 每组倒5个平板（Amp+），用于次周转化灭菌。八八实验安排实验安排周五：周五：n n用用Kit Kit 提取质粒提取质粒DNADNA，倒琼脂糖凝胶板（，倒琼脂糖凝胶板（1%1%），进行琼脂糖凝胶），进行琼脂糖凝胶电泳和浓度测定电泳和浓度测定n n每人分别提取每人分别提取pGFPuvpGFPuv、pBSKpBSK质粒质粒 各一管，每管各一管，每管60l60ln n取取1-2l1-2l电泳，电泳，1-5l 1-5l用用dd Hdd H2 2OO稀释后稀释后 在紫外分光光度计下测在紫外分光光度计下测 ODOD260260及及ODOD280280，并计算浓度，并计算浓度n n对质粒酶切过夜对质粒酶切过夜周六：周六：n n酶切样品琼脂糖凝胶（酶切样品琼脂糖凝胶（1%1%）电泳）电泳n n用用KitKit对酶切后的对酶切后的DNADNA（pBSK pBSK 大片段和大片段和GFPGFP基因片段）片段进行基因片段）片段进行胶回收胶回收n n每组用一个柱子回收每组用一个柱子回收n n电泳检测胶回收情况，用紫外检测回收电泳检测胶回收情况，用紫外检测回收 DNA DNA的浓度后，存放于的浓度后，存放于-2020冰箱中冰箱中八实验安排八实验安排-续续九九.DNA片段的连接片段的连接1.根据目的片段和载体大小，以等摩尔比（载体DNA：插入DNA片段=1:2 1:3）计算各自DNA加样量 连接体系：组组分分体体积积目的片段（目的片段（GFPGFP基因）基因）2 2 l lpBSKpBSK质质粒粒DNADNA1 1 l l1010连连接接酶酶bufferbuffer1 1 l lT T4 4DNADNA连连接接酶酶0.50.5 l lddHddH2 2O OXX l l合合计计1010 l l2.台式离心机离心10秒以混合均匀，16连接4小时至过夜，连接产物存放于4或直接转化细菌。