化学发光免疫分析与其他方法对比.ppt

化学发光免疫分析化学发光免疫分析 免疫学检测发展简介免疫学检测发展简介免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。免疫分析经历了放射免疫检验、荧光免疫检验、酶标免疫检验等不同时期，化学发光免疫检验是免疫分析发展的一个新阶段，它环保、快速、准确的特点已得到人们的普遍认识。因此化学发光免疫分析是通往免疫检验完美境界的必经之路。表1.1中国免疫诊断现状中国国际（欧美为主）放射免疫法（）兴起于20世纪70年代，现仍普遍使用于县级以上医院；产品处于衰退期；厂商试剂与仪器共同开发，试剂基本系列化。兴起于20世纪60年代，现已基本退出临床应用；产品生命周期已终结；厂商试剂和仪器共同开发，试剂基本系列化。酶联免疫法（）兴起于20世纪80年代，现普遍使用于各级临床机构，为我国临床免疫诊断的基本方法；产品处于成熟期；厂商试剂与仪器共同开发，试剂尚未系列化。兴起于20世纪70年代，现仍在临床应用；产品处于衰退期；厂商试剂与仪器共同开发，试剂基本系列化。化学发光免疫法（）导入于20世纪90年代，现个别较大医院开展个别项目；产品处于导入期或成长期；无厂商开发生产，完全依赖进口兴起于20世纪80年代，现已被临床普遍使用，成为临床免疫诊断的支柱方法；产品处于成熟期；厂商试剂与仪器共同开发，仪器自动化程度高，试剂系列化状态.化学发光免疫分析技术原理化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其机制为某些化合物（发光剂或发光底物）可以利用一个化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激态。当此产物分子或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。免疫测定(immunoassay)是利用抗原体反应来测定标本中微量物质的方法。1.使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。2.使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。3.洗涤后加入发光底物，酶促使发光底物发光，通过专用的仪器检测光子的数量，从而反算出未知抗原或抗体的浓度。化学发光免疫检测原理在化学发光免疫分析，其基本原理同酶联免疫技术（ELISA），常采用双抗体夹心法、竞争法、等反应模式，图1.2双抗体夹心法反应原理示意图化学发光免疫检测原理历史发展产品的对比：1、化学发光与酶免的对比2、化学发光与放免的对比3、化学发光与时间分辩荧光检测的对比4、化学发光的突出优点化学发光与酶免的对比酶免原理：1.使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。2.使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。3.洗涤后加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。化学发光免疫检测的灵敏度与可测范围远远高于酶免产品，兼具ELISA法简便的操作方法与较短的反应时间。化学发光与酶免的对比表：酶 标化学发光测量精度测量精度定性/半定量测量定量测量人体伤害底物有致癌性无有效期较长长干扰因素干扰因素较多极少测试项目测试项目少多化学发光与放免的对比放免原理是使用具有放射性的I125作标记物，然后用测量射线计数仪放射性（125I）。对环境的污染及对身体的危害，已经为重视环保的国家逐步取消。（如整个欧洲仅尚存几个放免试验室）125I的半衰期短而导致其试剂有效期短标记物125I的稳定性差，导致试剂盒批间、批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费。操作繁琐，出报告时间长。化学发光与放免的对比表：放 免化学发光测量精度测量精度较高高人体伤害放射性无有效期较长长干扰因素干扰因素较多极少测试项目测试项目较多多化学发光与时间分辨的对比化学发光与时间分辨的对比：时间分辨免疫检测原理时间分辨免疫检测原理和化学发光基本一样，只和化学发光基本一样，只是标记物改为稀土元素，不用发光底物但需要外在的稳是标记物改为稀土元素，不用发光底物但需要外在的稳定光源照射，光的波长产生定光源照射，光的波长产生stokestoke位移，并有一个时间滞位移，并有一个时间滞后以便于检测波长改变后的光子数量。后以便于检测波长改变后的光子数量。1 1、化学发光成本低于时间分辨荧光免疫分析、化学发光成本低于时间分辨荧光免疫分析 。2 2、化学发光比时间分辨荧光免疫试剂盒更稳定、化学发光比时间分辨荧光免疫试剂盒更稳定 3 3、化学发光免疫分析试剂盒对对测试环境条件要求低、化学发光免疫分析试剂盒对对测试环境条件要求低 。4 4、化学发光不需要外光源，仪器可靠性更高、化学发光不需要外光源，仪器可靠性更高化学发光与时间分辩荧光的对比：化学发光化学发光时间分辩荧光时间分辩荧光标记物标记物酶-发光底物两级放大 稀土离子，如铕 稳定性稳定性稳定性非常好 影响被标记物的生物活性与免疫活性 灵敏度灵敏稍高于化学发光反应体系反应体系接近中性 酸性，易引起蛋白质变性 包被技术包被技术不透明微量孔壁吸附,提高分析灵敏度,降低本底 采用透明微量孔壁吸附，孔壁的透明度会引起,本底干扰 技术性新技术，很成熟新技术，不成熟干扰因素干扰因素干扰极小 容易受内外源稀土离子的干扰 测试项目测试项目 项目齐全(见试剂报价单)缺少部分项目。如：贫血（叶酸，铁蛋白，维生素B12）化学发光免疫分析的优点：化学发光免疫分析的优点：1灵敏度高：这是CLIA关键的优越性，其灵敏度可达10-16mol/L（RIA为 10-12mol/L）。又 如 化 学 发 光 底 物（如AMPPD）可检测出的碱性磷酸酶的浓度比显色底物要灵敏5105倍。2宽的线性动力学范围：发光强度在46个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系。这与显色的酶免疫分析吸光度（OD值）为2.0的范围相比，优势明显。虽然RIA也有较宽的线性动力学范围，但放射性限制了其应用。3光信号持续时间长：辉光型（glow type）的CLIA产生的光信号持续时间可达数小时甚至一天。简化了实验操作及测量。化学发光免疫分析的优点：化学发光免疫分析的优点：4分析方法简便快速：绝大多数分析测定均为仅需加入一种试剂（或复合试剂）的一步模式。5结果稳定、误差小：样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，免除了各种可能因素（光源稳定性、光散射、光波选择器等）给分析带来的影响，使分析结果灵敏稳定可靠。6安全性好及使用期长：在上述优点前提下，更免除了使用放射性物质。到目前为止，还未发现CLIA的危害性。有效期可长达1年以上，放射免疫分析由于放射性同位素的衰变，一般有效期只有一个月，而酶联的底物贮存性差，都无法与化学发光相比，有效期长可以提高劳动效率，也利于推广应用。总结综合以上优点，目前已有的各种免疫分析尚没有出其右者，现在国外发达国家在CLIA的研究和开发方面进展很快，已有全自动的化学发光（闪光型和辉光型）与电化学发光免疫分析等系列产品。我国在化学发光免疫分析方面的研究还比较落后，这就是我国急需研究和发展CLIA的原因。基本性能对照表【化学发光免疫分析种类】1.直接化学发光A吖啶酯发光原原理理：纳米磁珠分离后的吖啶酯标记的抗原抗体复合物，在含H2O2的强酸、强碱激发底物的作用下，快速发出可见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强度RLU与待测抗原浓度成函数关系。特特点点：发光过程在5秒内完成，激发发光程序简单，测试速度快，但发光标记物吖啶酯在缓冲液中不稳定，易水解，影响试剂稳定性。代表仪器：代表仪器：拜耳公司的ACS180。【化学发光免疫分析种类】B异鲁米诺发光原原理理：发光过程和原理与吖啶酯完全相同，但激发发光速度更快，在3秒内完成整个过程，测试速度最快，而且克服了吖啶酯在缓冲液不稳定、易水解的缺点。代表仪器：代表仪器：德国BykSangtec公司的LIAISONC 电化学发光原原理理：纳米磁珠分离后的三联吡啶钌标记的抗原抗体复合物，在三丙胺的作用下，发生氧化还原反应，发出可见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强度RLU与待测抗原浓度成函数关系。特特点点：激发发光过程复杂，时间长，每一个发光过程约需25秒，测试速度慢。代表仪器：代表仪器：瑞士ROCHE公司的ELECSYS 1010和ELECSYS 2010。【化学发光免疫分析种类】2、酶促化学发光或持久发光原原理理：酶促化学发光一般是将碱性磷酸酶标记在抗体或抗原上，纳米磁珠分离后的碱酶标记的抗原、抗体复合物在发光底物AMPPD作用下，持续发出可见光，通过光电倍增管读取光信号。特特点点：激发发光时间长，测试速度慢，因为酶易受环境温度的影响，试剂的稳定性不如直接化学发光好。代代表表仪仪器器：美国贝克曼公司的ACCESS，雅培公司的AXSYM。