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琼脂糖凝胶电泳实验琼脂糖凝胶电泳实验2011-11-03 09:43:56来源：生物秀评论：0我要评论实验二琼脂糖凝胶电泳实验【实验目的】（1）学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；（2）掌握使用水平式电泳仪的方法；（3）学习在含有甲醛的凝胶上进行 RNA 电泳的方法。【实验原理】琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为，在常规的实验二 琼脂糖凝胶电泳实验【实验目的】（1）学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；（2）掌握使用水平式电泳仪的方法；（3）学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA 电泳的方法。【实验原理】琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为，在常规的电泳缓冲液中（pH 约），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：（1）DNA 的分子大小。线状双链DNA 分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA 分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。（2）DNA 分子的构象。当 DNA 分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA 在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋 DNA 移动得最快，而开环状 DNA 移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条 DNA 带难以确定是质粒 DNA 不同构象引起还是因为含有其他DNA 引起时，可从琼脂糖凝胶上将 DNA 带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的 DNA 图谱，则为同一种 DNA。（3）电源电压。在低电压时，线状 DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA 片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。（4）离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响 DNA 的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA 几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA 变性。溴化乙啶(Ethidium bromide,EB)（1）能插入 DNA 分子中形成复合物，在波长为254nm 紫外光照射下 EB 能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估算出待测样品的浓度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑，所以现在也开发出了安全的染料，如 Sybergreen。常规的水平式琼脂糖凝胶电泳适合于DNA 和 RNA 的分离鉴定；但经甲醛进行变性处理的琼脂糖电泳更适用于 RNA 的分离鉴定和 Northern 杂交，因为变性后的 RNA 是单链，其泳动速度与相同大小的 DNA 分子量一样，因而可以进行 RNA 分子大小的测定，而且染色后条带更为锐利，也更牢固结合于硝酸纤维素膜上，与放射性或非放射性标记的探针发生高效杂交。【试剂与器材】（一）材料（一）材料电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、琼脂糖等（二）试剂（二）试剂1、50TAE(1000mL)：242g Tris,冰醋酸，EDTA。2、EB 溶液：100mL 水中加入1g 溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。3、DNA 加样缓冲液：%溴酚蓝，%二甲苯青，50%甘油（w/v）。4、RNA 甲醛变性胶上样缓冲液：%溴酚蓝，%二甲苯青，1mM EDTA，50%甘油（w/v），用 DEPC水配制，高压灭菌备用。5、5甲醛变性胶电泳缓冲液：MOPS，40mM 醋酸钠，5mM EDTA，用 DEPC 水配制，过滤除菌，室温避光保存。淡黄色缓冲液可正常使用，深黄色应弃用。【操作方法】（一）常规的水平式琼脂糖电泳制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA 分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量；一般情况下，可参考下表：琼脂糖的含量（%）分离线状 DNA 分子的有效范围（Kb）60-520-11制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖，加入1x 电泳缓冲液，待水合数分钟后，置微波炉中将琼脂糖融化均匀。在加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。2 胶板的制备：将胶槽置于制胶板上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至50左右时，加入最终浓度为微克/毫升的 EB(也可不把 EB 加入凝胶中,而是电泳后再用 g/ml 的 EB 溶液浸泡染色15分钟)，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入1x 电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；3加样：点样板或薄膜上混合 DNA 样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 L 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量）。4电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA 的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当琼脂糖浓度低于%，电泳温度不能太高。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm 处时，停止电泳。5观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。在波长为254nm 的紫外灯下观察染色后之。（二）在含有甲醛的凝胶上进行的RNA 电泳（选做）配制23 mL 甲醛电泳胶：琼脂糖溶于20mL DEPC 水中，冷却至60C，加入5mL 的5x 甲醛变性胶电泳缓冲液和的甲醛，在通风橱内倒胶，冷却30分钟后使用。甲醛变性胶 RNA 样品的制备：1L RNA，5甲醛变性胶电泳缓冲液L，甲醛 L，甲酰胺2L，65oC加热15min，迅速冰浴，加1L 上样缓冲液和 L 的 EB。步骤：1 用3%过氧化氢浸泡电泳槽、胶板、梳子30分钟以上。2 胶板的制备：按常规琼脂糖电泳法。3 预电泳：1甲醛变性胶电泳缓冲液，预电泳10 min。电压为5V/cm。4 小心地进行点样，记录样品次序与点样量；然后开始电泳，电压为3-4V/cm。5 观察和拍照：在波长为254nm 的紫外灯下观察电泳胶板并拍照保存图片。【注意事项与提示】（1）EB 是强诱变剂并有中等毒性，易挥发，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB 洒到桌面或地面上。凡是沾污了 EB 的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。简单处理方法为：加入大量的水进行稀释（达到mL 以下），然后加入倍体积新鲜配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和倍体积新鲜配制的 L 的亚硝酸钠，混匀，放置1天后，加入过量的1mol/L 碳酸氢钠。如此处理后的 EB 的诱变活性可降至原来的1/200左右。（2）由于 EB 会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使 DNA 迁移率降低。因此，如果要准确地测定 DNA 的分子量，应该采用跑完电泳后再用 g/ml 的 EB 溶液浸泡染色的方法。（3）总RNA 的分析：哺乳动物的RNA 由28S rRNA、18S rRNA 和 mRNA 以及其它小分子 RNA 组成，28S 和18S rRNA 处为明显的亮带（相当于和），28S/18S应为；植物、昆虫、酵母和两栖动物的 RNA 带分布较小，约为左右；假如28S/18S小于1/1，或者出现拖带，说明RNA 已经有部分降解，如果28S 和18S rRNA 大部分已降解，则需重新制备。【实验安排】只需一天：上午配试剂倒胶，下午跑电泳并观察拍照。【实验报告要求与思考题】1、附上电泳结果的图片并进行正确的标注（如下图）（2）的或已加有EB 的电泳胶板。DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。于凝胶成像系统中拍照并保存M：1Kb DNA ladder；1：质粒 DNA2、琼脂糖凝胶电泳中 DNA 分子迁移率受哪些因素的影响？3、如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因电泳流程图：凝胶加样缓冲液缓冲液类型6缓冲液%溴酚蓝%二甲苯青 FF440%（W/V）蔗糖水溶液溴酚蓝%二甲苯青 FF室温15%聚蔗糖(Ficoll400)%溴酚蓝%二甲苯青 FF430%甘油水溶液%溴酚蓝40%(W/V)蔗糖水溶液碱性加样缓冲液:300mmol/L NaOH6mmol/L EDTA18%聚蔗糖(Ficoll400)%溴甲酚绿4%二甲苯青 FF使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保 DNA 均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF 的倍，而与琼脂糖浓度无关。以TBF 作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速 率约与长 300bp 的双链线状 DNA 相同，而二甲苯青FF 的泳动则与长 4kb 的双链线状 DNA 相同。在琼脂糖浓度为%的范围内，这些对应 关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性 pH 条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。4贮存温度