1版-国家自然科学基金(1).docx

国家自然科学基金申请书(2 0 2 2 版)资助类别：亚类说明：附注说明：工程名称：脆弱拟杆菌抗衰老、延缓阿尔茨海默症及抑制糖尿病作用机制研 区申 请人： 路 旭 电 话： 13664116435依托单位：通讯地址：邮政编码： 单位 ：电子邮箱：申报日期：2022年03月02日国家自然科学基金委员会批注|hI0|: 一句话总结：衰老与自由基，炎症因子有 关.此处应该加入衰老与益生菌的国内外研究进展(malondialdehyde, MDA),是氧化应激的标志物，反映细胞受损程度9,10。研 究说明丙二醉-赖级酸(malondialdehyde-lysine, MDA-Lys)随着年龄的增长在组 织中积累，其浓度越低时动物的寿命越长11。老化的皮肤不仅表现出皱纹、肤 色不均、失去弹性和变薄，而且表现出愈合延迟、反复感染以及良性和恶性肿瘤 的发病率升高，而皮肤老化局部是由转化生长因子 transforming growth factor-p» TGF-P)引起，它通过阻止真皮成纤维细胞转化为脂肪细胞来减少皮下脂肪。当 作为支撑的脂肪细胞减少时皮肤会变松弛和起皱，因此其也为抗衰老程度的生 物学指标12。研究显示1L-10作为一种强效抗炎细胞因子，可减轻与衰老相关 的炎症并改善骨骼肌中的胰岛素信号传导和葡萄糖代谢“31。目前研究多集中于 乳酸杆菌属 (Ladobacilhis sdd.) 和双歧杆菌属 (Bifidobacterium sdd) 抗氧化研 究251。郑晓楠的综述文章中描述了 2010年研究H本发酵食品中别离到菌株 Lactobacilhis Dlanfanim有清除自由基的作用，文中也描述益牛.菌细胞壁成分被 报道有延缓细胞衰老特征，可降低P2I表达，增强cChE及CDk2的表达水平 24。Sivamarulhi 于 2018 年发表综述中报道多项研究发现益生菌(/,. gasseri SBT2055 和 A sH八-"/us FDB89)和芽胞杆菌(Bacillus iichenifbrmis)对秀丽隐 杆线虫(Caenorhabdilis eleRanC 模型直延及寿命的作用，文中同时描述 了益生 菌可延缓小鼠模型衰老及Lactobacillus /antarum HY7714可减少志愿者皮肤皱 纹深度，改善皮肤光泽和水分等126。研究发现益牛菌可以恢复酸性皮肤的pH 值、缓解氧化应激、减弱光老化、改善皮肤屏障功能并优化发质27。虽然目前 有一些关于益生菌抗衰老功能的相关研究报道，但用于延缓及抗衰老的益生菌 仍然有限。阿尔茨海默症(Alzhcimc否disease, AD)是德国精神病学家和病理学家阿 洛伊斯阿尔茨海默于1906年首次发现，并用其名字命名14。该病是种神经 退行性疾病，通常开始缓慢并逐渐恶化，为60-70%的老年痴呆病例的原因15。 AD的病症分三个阶段(早期、中期和晚期)，疾病会逐渐恶化且可能早在临床 病症出现之前几十年就出现了16。截至2020年，全世界约右. 5000万人患有 AD170 2015年的数据显示痴呆症导致约190万人死亡口8。AD被认为是在大 脑中形成异常数量的细胞外供淀粉样蛋白(AQ,在细胞外以淀粉样蛋白斑块和 lau蛋白的形式积聚，或在细胞内以神经原纤维缠结的形式积聚，影响神经元功雅普总体：小四字体颜色:自动设置图案,批注|hlll： 一般自己画图或干脆删除Intestinal Microflora 1014 nwroortMMm. »S00 tpMiMFig.l胃肠道内微生物概况能和连接性，导致大脑功能逐渐丧失19。A0沉枳和弥漫性老年斑形成会导致 产牛.局部小胶质细胞活化和促炎细胞因子20,这些细胞因子刺激反响性星形胶 质细胞产生更多的Ap42寡聚体（Ap异构体，被认为是自然界中最具神经毒性）, 可激活更多的淀粉样斑块形成21。此外，AP寡聚体聚集会诱导氧,化损伤而引 发炎症并促进tau过度磷酸化，影响神经元突触和线粒体22。目前没有任何药 物被证明可以降低患AD的风险23,因此能够有效对抗这种疾病的新治疗方案 至关重要。益生菌在改善阿尔茨海默症中的研究进展糖尿病是最常见的疾病之一，严重地影响了民众健康。目前全球糖尿病患者 人数多达近4亿人，据估计到2030年全世界糖尿病患者将到达5.5亿33。糖代 谢异常会引起的糖脂转运蛋白的含量改变。常见的糖尿病类型为1型糖尿病、2 型糖尿病和妊娠糖尿病随着时间的推移，高血糖会导致诸如心脏病、中风、肾脏 疾病、眼睛问题、牙病、神经损伤和足部问题34。尽管糖尿病无法治愈，但采 取有效的措施仍可控制糖尿病。目前治疗糖尿病药物虽然可以控制血糖，但对人 体也会产生副作用。常用的胰岛素及其类似物作为一种高效的降血糖药物，为医 治糖尿病常见方法，但其副作用（出汗、头晕或头晕、颤抖、饥饿、心率快、难 以集中注意力或混乱、模糊的视野和手、脚、嘴唇或舌头刺痛）会给患者的身体 造成一定的危害（ht（ps:/ hcallhlinc.coni'lhcalth.'drugs/rcgular-insulin-inicctablc- solution）0，中等强度的运动可以改善肥胖者的总体代谢状况，且脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)隶属于拟杆菌门，拟杆菌科，拟杆菌属， 为一种专性厌氧革兰氏阴性杆菌，多形或杆状，最适生长温度及pH值分别为 37和7,可分为产肠毒素型(ETBF)和非产肠毒素型(NTBF) 43,44。它通 常与人类结肠共生，存在于人体胃肠道中的2g对健康的胃肠道功能(如 粘膜免疫和宿主营养)至关重要43。脆弱拟杆菌是哺乳动物肠道正常定殖的细 菌，然而当机体某一部位受损或预先有病理改变时，B -agi加易位成为条件致 病菌。的致病性包括荚膜、外膜蛋白 (outer-membrane proteins, OMP) 和锌依赖性金属蛋白的毒素脆弱拟杆菌毒素(B. fragilis toxin, BFT) 45o BFT 有bft-K bn-2和bft-3三种基因型,其表达可切割钙黏蛋白E (E-cadherin,为 细胞间粘附蛋白)的胞外结构域，导致钙黏蛋白E完全降解，影响小肠上皮细胞 中的小带粘附和紧密连接，导致上皮细胞肌动蛋白细胞骨架的重排46。42 输孤拟杆菌的致病与益牛持忸:研究讲屏申请人拟提出以下科学假说：I)脆弱拟杆菌作为潜在的延缓衰老益生菌作 用于ICR小鼠衰老模型可上调氧化酶诱导对机体的保护作用：上调抗炎因子和 下调促炎因子和转化生长因子来延缓衰老：同时下调MDA和MDA-Lys影响衰 老程度。2)脆弱拟杆菌作为潜在的缓解小鼠AD病症的益生菌可提高Tg2576小 鼠记忆和认知能力；上调抗炎因子和下调促炎因子；减少A0斑块、Ap42其聚 体及降低tau蛋白磷酸化水平等以证明此菌株可缓解小鼠AD病症。3)脆弱拟 杆菌作为潜在的降低血糖缓解肺尿病的益生菌调节血糖及m-GLUT4等蛋白。 参考文献Ahmed. 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Science, 2015. 350(6264): p. 1079-84.2.工程的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题(此 局部为重点阐述内容)；研究内容：研究说明脆弱拟杆菌在抗衰老、免疫调节、促进糖代谢笫方面起着重要的 作用，并且其对胃酸的耐受件装好，能够在肠道中打效定植，发挥只作用，极 具益生菌价值U脆弱拟杆菌8Fg犯完仝无毒副作用，肠道存活率可高达 9958%,可作为本实验研窕的菌株本研究拟采用脆弱拟杆菌BF839港口处理 三种小鼠模型，分别为ICR衰老小鼠模型、AD转基因小鼠Tg2576和db/db 型糖尿病小鼠模型，探究其抗衰老、延缓阿尔茨海默症以及抑制糖尿病的作用 机制。或可为有效临床治疗提供一条更为高效、精准和副作用小的治疗方法。为了验证该假说和推论，本工程拟完成4方面的工作：I)脆丽拟杆菌BF839发酵条件优化稳定培养菌株：2)探窕脆弱拟杆菌BF839作为潜在的益生菌在衰老小鼠模型中的抗衰老作 用：3)脆弱拟杆菌BF839作为潜在的益生菌在AD转基因小鼠模型中延缓和治 疗阿尔茨海默症中的作用：4)脆弱拟杆菌BF839作为潜在的益生菌在db/db II型糖尿病小鼠预防和治疗糖尿病中的作用机制。2.1 研究目标：1).应用脆弱拟杆菌可以使ICR小鼠衰老模型延缓衰老的作用与机制。2),应用脆弱拟杆菌可以使AD转基因小鼠模型AD病症减轻，提高记忆和认 知。减轻作为潜在的缓解AD患者病症的益生菌可提高Tg2576小鼠记忆和认 知能力的作用与机制。3) .T*用脆弱拟杆菌可以使db/db II型糖尿病小鼠血糖降低及耐糖量升高的但11 与机制,探究相关糖脂转运蛋白变化。4) .大规模发酵脆弱拟杆菌获得脆弱拟杆菌菌液。2.3重点解决的关键技术问题：1)脆弱拟杆菌BF839活化及发酵培养行16SrDNA分子鉴,定-l鉴定无误后待备用u建立小鼠麦老模型，在一定时间内，连续给通过颈背部皮下以QXng/kg 注射或者腹腔注射D半乳糖6周以上，使机体细胞内衰老通过与百然麦老小鼠 比照无显著差异即建模成功U对ICR小鼠衰老模型进行脆弱拟杆菌灌胃处理后，从血液中别离血清， ELISA 测定 SOD、GSH、GSH Px、和 CAT 等含吊及活性：qRT PCR 及 Western bk)l测定IL-64L-12,TNF-a,IL-lB，TGF-B/L-10和等抗炎' 促炎国子和转化生长 因子等：ELISA,测定小尿肝中MDA和 MDA-Lys”对Tg2576小鼠.模型进行脆弱拟样落灌以处理后对-不同年龄段小鼠进住¥ 型迷宫测试-从血诙中别离血清，分析小鼠学刊记忆能力1人般条件性恐惧测试 分4fr学7 记忆能力：qRT PCR 及 WeMeorblet测定 FL6rFfc-BTNF a, IL 甲、 TGF伏IL 10和-feu蛋白磷酸化等炎性因产的变化情况等l刚果红染色显微检测 A0斑块，分析那班块块升常：MTT法检测A°42与聚体细胞毒性u对db/dbII型糠尿病小鼠模型进行脆弱拟杆菌灌胃处理后，测定空腹血糖及 在箱萄糖灌胄处理后尾脉采血测定糖耐量：GC/MS测定小就足脉他中短链脂肪 酸，胆汁酸，维牛素K与对照组的差异：Weslemblotling法检测小尿腓肠肌和海 "“内 e Gi.iiT-1 一一 rnaa一 rPT-i u Ki patpi 笺击白:华 居一7 TjIT X X 11 IX-J x-lx >I IIjIIi I .J X*s TJ <1L 7 | U3.1研究方法：引进脆弱拟杆菌BF839菌种，并建立脆弱拟杆菌BF839发酵条件。将脆弱拟杆菌BF839对加速衰老动物模型ICR衰老小鼠、AD转基因小鼠Tg2576及 db/db型糖尿病小鼠模型进行灌目处理.，并检测ICR衰老小鼠血清中MDA、 LPF、GSH-Px、SOD、CAT等含量及活性、通过Y迷宫实除中的交替行为和条件性 恐惧测试检测Tg2576小鼠的学习、认知、记忆能力以及H型糖尿病小鼠血清中 血糖含量、糖耐虽:、体重等指标。分析实验数据，得到实验结果。上述所采用的 技术方法成熟可行。脆弱拟杆菌BF839活化及发酵培养购买脆弱拟杆菌BF839菌株，活化，小规模液体发酵培养，对培养产物进 行16SrDNA分子鉴定，鉴定无误后待备用。2） ICR小鼠衰老模型构建建立小鼠哀老模型，在一定时间内，连续给通过颈背部皮下以125 mg/山 注射或者腹腔注射D-半乳糖6周以上，使机体细胞内衰老通过与自然衰老小鼠 比照无显著差异即建模成功。3）腌弱拟杆菌灌胃处理ICR衰老小鼠模型并测定天然抗氧化酶等对ICR小鼠衰老模型进行脆弱拟杆菌灌胃处理后，从血液中别离血清， ELISA 测定 SOD、GSH、GSH-Px、和 CAT 等含量及活性；qRT-PCR 及 Western blot测定IL6IL-12,TNF-a,IL-lB,TGFIL-10和等抗炎、促炎因子和转化生长 因子等；ELISA测定小鼠肝中MDA和 MDA-Lys。4）脆弱拟杆菌灌胃处理122576小鼠模型并测定记忆认知对以2576小鼠模型进行脆弱拟杆菌灌胃处理后，对不同年龄段小鼠进行Y- 型迷宫测试，从血液中别离血清，分析小鼠学习记忆能力；小鼠条件性恐惧测试 分析小鼠学习记忆能力：qRT-PCR及Wesiem blot测定IL-6, IL-12, TNF-aL-l氏 TGF-BJL-I0和tau蛋白磷酸化等炎性因子的变化情况等：刚果红染色显微检测 AB斑块，分析AB斑块块异常；MTT法检测AB42寡聚体细胞有性。5）脆弱拟杆菌灌胃处理db/db H型糖尿病小鼠模型并测定血糖等对db/dbH型糖尿病小鼠模型进行脆苑拟杆菌灌胃处理后，测定空腹血糖及 在葡萄糖灌II处理后尾脉采血测定糖耐量；GC/MS测定小鼠尾脉血中短链脂肪 酸，胆汁酸、维生素K与对照组的差异；Wesiem blolling法检测小鼠腓肠肌和海 马内 m-GLUT4、HMGCR、CD36、CPT-1 a in FATP1 等蛋白差异。(以上以同量生理盐水为对照组)(1)脆弱拟杆菌BF839发酵培养条件的建立；(2)脆弱拟杆菌BF839抗衰老、延缓阿尔茨海默症作用研究:(3)脆弱拟杆菌BF839抗糖尿病作用机制研究。3） 2技术路线：批注|hl7:已有的收究我明I单出M”国时鬓扁人体生短： 2JUH偏代时匕的能力突出 3.就炉内“<1的外表尺“上冷美校？K«I*PSA*1 标ultra生作|即 双杆偷HR(柘笈防及收*AMi等“化欠缺9*功呷可行帔¥入0发a牛及遇竹石楼澳叱所动及抑KR小M “懵一tttfiaHABFMQ个板温化才Nitll&MWn>id个4发W -*T2576d'K过国内第a牛0及无/粗杆编的广迁应用我的心 I.1 It“费*1已"6小及认 Mil 力,3.用明8低,及构制双蝴的作网机.O依依小学fla、'建京次收中的2将行为对M 后惧实试再崇仪的40记七十力ELISA. ?RTiyiLWctcEbto<,功HQ别离*泊-L| 小6 CXCL2. NLRP3. 1L" IL10 |木里红金色MR酒第2及统.MTT"./离2cM |量体.ELISA已用血业门债融化Fig.2本研究拟采取的技术路线图似机M*究注:ELISA：陂联免疫吸附剂测定：qRT-PCR：荧光定量PCR; Western blot：蛋白质印迹法： MTT： MTT比色法:IL-6、IL-12、TNF-a和IL-lfi：促炎细胞因子(IL：白细胞介素和TNF： 肿瘤坏死因子)：IL-I0：抗炎细胞因子；TGF-p：转化生长因子;MDA：丙二醛:MDA-Lys： 丙二醛赖女酸：CXCL2：小鼠CXC趋化因子配体2： NLRP3含有NOD-、LRR-和pyrin 结构域的蛋白质3; GLUT4:葡萄糖转运蛋白：GSHMGCR:抗3-羟基3-甲基戊二酰辅陶A 还原酶;CD36:受体蛋白;CPT-la:酰基转移酶;FATP1: FATP1蛋白；脂肪酸转运蛋白1.3.3实验手段及关键技术：建立脆弱拟杆菌BF839规模化发酵条件。 检测ICR衰老小鼠模型血清中SOD、GSH、GSH-Px和CAT等含量。 检测AD转基因小鼠Tg2576的学习、认知、记忆能力:qRT-PCR及Western blot 测定 IL-6, IL-12, TNF-a, IL-10, TGF-p, IL-10 和 tau 蛋白磷酸化等变 化情况。(4)检测db/db II型糖尿病小鼠血清中血糖含量、糖耐量及体重等:GC/MS 测定尾脉血中短链脂肪酸，胆汁酸，维生素K含量差异；Western blotting 法检测小鼠腓肠肌和海马内m-GLUT4、HMGCR, CD36、CPT-1。和 FATP1等蛋白差异。4 .本工程的特色与创新之处；1) .本项研究课题的构思和设计源自国内外关于益生菌及脆弱拟杆菌前期工 作基础，瓷阅大量文献及资料是山浅入深、山现象到机制、由理解到验证的进一 步探索。目前，脆弱拟杆菌用于抗衰老研究及其对阿尔茨海默症的作用研究仍旧 空白，且已有研究说明脆弱拟杆菌确有抑制糖尿病效果，但其抑制糖尿病的机制 尚无相关研究。本研究将使用多种生物学分析方法和检测手段，从多角度证明课 题的假说。2) .本课题从全新的角度，首次探讨脆弱拟杆菌BF839用于抗衰老、延缓阿 尔茨海默症和抑制及改善糖尿病的机制研究。3) .本课题创新性地从反响机理、交互作用、因果关系、真相本质等多方面解 密脆弱拟杆菌抗衰老、延缓阿尔茨海默症和抑制糖尿病机制。从动物活体实验得 到的结果将验证我们提出的课题假说。5 .年度研究计划及预期研究结果(包括拟组织的重要学术交流 活动、国际合作与交流计划等)。5.1. 年度研究计划2022.01-2022.12购置实验仪器及实验耗材；购置的脆弱类杆菌菌株BF839活化培养并进行液体发酵培养；购置三种小鼠进行培养，同时D-半乳糖诱导ICR小鼠至其为衰老小鼠模型。202