安捷伦高效液相色谱基本原理-理论.pptx

成就您的科学探索之路安捷伦与您同行,高效液相色谱基本原理 理论,安捷伦科技致力于为教育领域做出贡献，并愿意提供这里所包含的为公司所拥有之资料的访问权限。本幻灯片集由安捷伦科技制作。幻灯片集的使用仅限于教学目的。其中所包含的资料和信息被“原样”接受，安捷伦对于资料不作任何形式的陈述或担保，并且对于您对资料的使用或复制不承担责任。由于您使用、复制或传播这些资料所引起或相关之损失，安捷伦不承担责任。您同意赔偿并使安捷伦免于遭受由于您使用或复制这些资料所招致的任何索赔。,前言,高效液相色谱（HPLC，曾称为高压液相色谱）是分析化学领域的一项技术，可用于分离混合物中的多种组分、对每种组分进行鉴定，以及对组分进行定量分析。 HPLC 利用泵使含有样品混合物的加压液体溶剂通过填充有固体吸附材料的色谱柱。样品中的每种组分与吸附材料的相互作用都略有不同，这使不同组分具有不同流速，从而当它们流出色谱柱时即可实现分离。,目录 (ToC),前言色谱柱内部的作用原理关键参数保留时间与峰宽分离度 基线分离分离度 基本公式柱效或理论塔板数保留因子选择性或分离因子影响选择性的因素选择性 示例 1选择性 示例 2选择性 示例 3塔板数,Van Deemter 方程涡流扩散纵向扩散传质阻力有关 Van Deemter 方程的更多内容峰容量梯度分析定义峰容量计算峰宽示例,前言色谱柱内部的作用原理,前言色谱柱内部的作用原理,tr2-tr1,较好分离,较差分离,较好分离,较差分离,Wb1,Wb2,Wb1,Wb2,对比,对比,tr2-tr1,前言色谱柱内部的作用原理,分离度是对色谱柱分离目标峰能力的描述。 分离度大小能表示是否实现了基线分离。,关键参数保留时间与峰宽,tr1,tr2,Wb1,Wb2,W1/2,h,t,tri化合物 i 的保留时间W1/2半峰高处的峰宽Wbi基线峰宽,关键参数 分离度 基线分离,分离度是对色谱柱分离目标峰能力的描述。分离度将受到柱效 (N)、选择性 (a) 和保留 (k) 的影响。可以进行充分定量分析的可测分离的最小分离度为 1。 可辨别出两个等高峰之间峰谷的最低分离度为 0.6。 稳定的分析方法通常需要分离度达到 1.7 或更高。 1.6 被认为是达到基线分离，并且可确保获得最准确的定量分析结果的标准分离度。,Rs = 1.5,关键参数分离度 (U)HPLC 的基本方程式,我们可以通过优化下述任何一个参数来改善分离度：选择性对分离度影响最大。选择性的微小变化即可导致分离度的极大改变。保留只在 k 值小的时候有显著影响。柱效描述了色谱柱的分离能力。,关键参数分离度 (U)HPLC 的基本方程式,该图阐明了分离度是选择性、柱效和保留的函数。,选择性对分离度的影响最大改变固定相改变流动相塔板数最容易增加,关键参数 柱效或理论塔板数 (N),柱效用于比较不同色谱柱的性能。由理论塔板数 N 表示。具有高塔板数的色谱柱柱效更高。与具有较低塔板数的色谱柱相比，具有高塔板数的色谱柱在给定保留时间处可以获得更窄的色谱峰。影响柱效的参数：柱长（增加柱长可以提高柱效）填料粒径（减小填料粒径可以提高柱效）,关键参数保留因子 (k),保留因子测定了样品组分在固定相与流动相中的保留时间之比。它是用保留时间除以不保留峰的出峰时间 (t0) 计算得出的。影响保留因子的参数：固定相流动相梯度斜率*系统驻留体积*,*仅指梯度洗脱,该方程式显示出流速 (F)、梯度时间 (tG)、梯度范围 () 和柱体积 (Vm) 是如何影响保留因子的。 请记住：为使保留因子保持恒定，分母的改变需要由分子相应按比例改变来抵消，反之亦然。,关键参数保留因子 (k) 梯度洗脱,关键参数选择性或分离因子 (),选择性是两个峰顶点间时间或距离的量度。如果 = 1，则两个峰具有相同的保留时间，并且会被共洗脱。它被定义为容量因子之比。影响保留因子的参数：固定相流动相柱温,a选择性k1第一个峰的保留因子k2i第二个峰的保留因子,关键参数N、 及 k 对分离度的影响,影响分离的因素,同一种样品采用不同固定相，但始终采用相同柱温、流动相和梯度进行分析。,影响分离的因素,同一种样品采用相同固定相和柱温，但采用不同流动相进行分析（相同梯度）。,同一种样品采用相同固定相、流动相及相同梯度，但采用不同柱温进行分析。,影响分离的因素,影响分离的因素HPLC 中“塔板”的含义,理论塔板是一种假设的分离阶段，其中一种物质的两相（液相和气相）达到平衡。,LC柱长dp填料粒径h折合理论塔板高度,影响分离的因素,高塔板数 (N) 可提供：尖锐的窄峰更出色的检测能力分离复杂样品的峰容量但分离度只随塔板数平方根的增大而提高。 RS N塔板数的增大受实验条件的限制 分析时间、柱压,影响分离的因素将峰宽和折合理论塔板高度结合起来,h：折合理论塔板高度,Van Deemter 方程涡流扩散,weddy dp,：色谱柱填料的品质,扩散路径的不同是由于：,Van Deemter 方程轴向或纵向扩散,由于分析物的自身扩散导致峰宽增大低流速时，分析物会在流动相中保留很长时间峰宽的显著增大理论塔板高度的增大,流速,Van Deemter 方程“传质阻力”,wC dp2,不同的扩散路径,多孔填料,流动相的固定层,Van Deemter 方程,Van Deemter 方程通过综合考虑分离过程中引起峰展宽的物理学、动力学和热力学因素，将分离柱单位长度的总峰展宽与流动相线性速率联系起来（维基百科）。,h = f ( weddy + wax + wC )h = A + B/u + C u,涡流扩散扩散系数传质阻力,Van Deemter 方程,折合理论塔板高度 (h),流速,涡流扩散,h = A,+ B/u,+ C u,Van Deemter 方程针对不同填料粒径进行测定,5.0 m,3.5 m,1.8 m,使用小粒径填料可以获得较小的理论塔板高度，从而实现更高的分离效率对于更小粒径的填料，流速提高时分离效率的损失更少化合物和仪器特异性最佳流速取决于具体化合物,等度运行：峰宽仅取决于扩散过程。梯度运行：峰宽取决于扩散过程和柱头梯度聚焦。,峰容量梯度分析,折合理论塔板高度是峰宽的函数,峰容量是指在给定时间和分离度条件下可以分离的色谱峰数目 (n)。峰容量取决于柱长和填料粒径等不同的因素。,峰容量定义,峰容量：2.5 min 内的 32 个峰,峰容量峰容量的计算,简化式：,wav平均峰宽n峰数tG梯度运行时间w所选峰的峰宽,峰容量峰宽,根据切线法得出的峰宽,半峰宽,5% 峰高处的峰宽4.4% 峰高处的峰宽 (5),峰容量示例,色谱柱：2.1 x 150 mm，1.8 µm背压：402 bar峰容量：313,色谱柱：2.1 x 300 mm*，1.8 µm背压：598 bar峰容量：406,*两根 150 mm 色谱柱连接而成的 300 mm 色谱柱,更多信息,如需了解安捷伦产品的更多信息，请访问 www.agilent.com 或 www.agilent.com/chem/academia对此幻灯片演示有问题或建议？请联系 academia.teamagilent.com,谢谢,5991-5411CHCN,缩写词,